[發明專利]一種利用葡萄糖轉化豐原素高產菌株的構建方法

有效

• 申請號: 202110560598.X
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113265414B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 聞建平;何明亮;銀瑩
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/31;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發明提出了利用葡萄糖轉化豐原素高產菌株的構建方法，將來自枯草芽孢桿菌168的P43啟動子基因、degQ基因和來自解淀粉芽孢桿菌FZB42的sfp基因串聯組成了基因表達模塊pHP13?P43?sfp?degQ，將此模塊轉移到枯草芽孢桿菌168原始菌株內，獲得合成豐原素的菌株細胞BSP000。通過構建BSP000菌株基因組尺度代謝網絡模型預測出accA、cypC、gapA三個過表達目標靶基因，通過將這三個基因在BSP000菌株內過表達，獲得了豐原素高產工程菌株BSP003，其豐原素發酵產量達到59.87mg/L，較人工菌株BSP000提高了126％。為實現豐原素的工業化生產具有實際的應用價值。

技術領域

本發明屬于枯草芽孢桿菌基因工程技術領域，具體涉及通過將sfp基因degQ基因串聯共表達，構建能夠利用葡萄糖合成豐原素的基因工程菌株的方法，以及利用模型模擬出目標靶基因進行過表達，最終實現該工程菌株豐原素產量的提高。

背景技術

木質纖維素是目前地球上豐富的可再生資源，經過水解后可生成阿拉伯糖、木糖等五碳糖以及葡萄糖、半乳糖等六碳糖。利用生物法對木質纖維素進行綜合治理和利用，這將有利于環境問題的解決。

目前自然界中存在利用葡萄糖轉化豐原素的菌株，如BacillusamyloliquefaciensLPB-18N(CN201911402559.6)。但是木質纖維素水解液的成分復雜，所以需要利用多菌群細胞體系對其進行處理。下面我們對利用葡萄糖轉化豐原素人工細胞的研究是十分必要的，這是我們開展多人工細胞群相互關系研究的出發點。

豐原素的生物活性與部分化學類農藥相當，能夠顯著抑制植物真菌的生長，但是對酵母和細菌沒有明顯的抑制效果。像豐原素這類非核糖體肽抗生素一般具有比較獨特的生物活性功能，對于能夠生產這類抗生素的微生物本身來說，這些非核糖體肽抗生素可以幫助它們更好地適應生存環境，尤其在遇到與其他真菌或細菌生存競爭時，可以抑制或著殺死對手，極大地提高自身的競爭能力。近年來國內外有許多學者對豐原素的抑菌活性做了大量研究，豐原素在有效防治植物病害等方面具有非常廣泛的應用(CN201810540353.9)。

枯草芽孢桿菌中的豐原素合成基因簇共用同一個啟動子pfen，并且合成基因簇包括fenC，fenD，fenE，fenA，fenB這五個按照順序依次排列的編碼基因，每一個編碼基因可以編碼一個亞基實現特定的催化功能，五個亞基的依次作用可以實現一個豐原素分子的合成，基因簇序列全長為38.7kb。豐原素分子是由β-脂肪酸鏈和肽環兩部分組成的，其中的多肽部分的合成與普通的多肽合成不同，它是由非核糖體肽合成酶合成的，非核糖體肽合成酶包含多個功能模塊，例如腺苷酸化結構域A，縮合結構域C和肽酰基載體蛋白PCP等，在非核糖體肽合成酶發生作用時，其內部的各個模塊可以分工合作將特定的氨基酸進行活化并把氨基酸連接在肽鏈上促使肽鏈的延伸，直至多肽合成完畢。

雖然豐原素擁有很好的抗真菌活性，然而其由于產量低受到了很大的限制，因此已經有很多研究人員為提高菌株豐原素的最終產量而進行了多方面研究，比如盧等人通過構建基因敲除突變株，可以使得豐原素產量提高72％(CN201911399328.4)等。通過在豐原素發酵培養基中添加K⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺等金屬元素，結果表明枯草芽孢桿菌的生物量得到了明顯提高，與此同時豐原素的產量也得到了顯著提升。

葡萄糖作為木質纖維素重要的水解產物，它的有效利用對于木質纖維素的降解具有十分重要的意義。底盤細胞枯草芽孢桿菌168菌株雖然可以利用葡萄糖進行生長，但是卻不能合成目的產物豐原素。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明構建了可以利用葡萄糖合成豐原素的枯草芽孢桿菌菌株，又針對菌株豐原素產量低的問題設計了基因組尺度代謝網絡模型，在其指導下對菌株進行了基因工程改造，提高了豐原素的產量。