[發(fā)明專利]一種利用葡萄糖轉(zhuǎn)化豐原素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110560598.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN113265414B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聞建平;何明亮;銀瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/31;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種利用葡萄糖轉(zhuǎn)化豐原素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法；其特征是，包括如下步驟

1)根據(jù)P43啟動(dòng)子基因的已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，擴(kuò)增出P43啟動(dòng)子基因；

2)根據(jù)sfp基因的已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，擴(kuò)增出基因sfp；

3)根據(jù)degQ基因的已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以解淀粉芽孢桿菌FZB42基因組為模板，擴(kuò)增基因degQ；

4)將基因sfp與基因degQ通過酶切酶連與pHP13質(zhì)粒串聯(lián)成一基因表達(dá)模塊pHP13-P43-sfp-degQ；

5)將步驟4)中構(gòu)建好的重組基因表達(dá)模塊pHP13-P43-sfp-degQ通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌168原始菌株中，構(gòu)建了可以利用葡萄糖合成豐原素的菌株BSP000；

6)針對(duì)BSP000菌株，從數(shù)據(jù)庫中收集菌株全部的基因-蛋白-反應(yīng)信息，經(jīng)過添補(bǔ)缺失反應(yīng)、移除多余反應(yīng)等優(yōu)化后，構(gòu)建出BSP000菌株的基因組尺度網(wǎng)絡(luò)代謝模型；

7)將步驟6)中構(gòu)建好的網(wǎng)絡(luò)代謝模型利用通量平衡分析和最小代謝調(diào)節(jié)算法進(jìn)行計(jì)算，得到accA、cypC、gapA三個(gè)過表達(dá)目標(biāo)靶基因；

8)根據(jù)accA、cypC、gapA基因的已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，擴(kuò)增出基因accA、cypC、gapA；

9)將accA、cypC、gapA基因通過酶切酶連與pHY300PLK質(zhì)粒串聯(lián)成基因過表達(dá)載體pHY300ACG；

10)將步驟9)中構(gòu)建好的基因過表達(dá)載體pHY300ACG通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移到BSP000菌株中，獲得BSP003菌株；

11)將步驟10)中構(gòu)建好的基因工程菌株利用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，高效生產(chǎn)豐原素。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，P43啟動(dòng)子基因核苷酸序列為SEQ ID NO:1。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，sfp基因核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，degQ基因核苷酸序列為SEQ ID NO:3。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，pHP13質(zhì)粒核苷酸序列為SEQ ID NO:4。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，accA基因核苷酸序列為SEQ ID NO:5。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，cypC基因核苷酸序列為SEQ ID NO:6。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，gapA基因核苷酸序列為SEQ ID NO:7。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，pHY300PLK質(zhì)粒核苷酸序列為SEQ ID NO:8。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.4g/L，NaH₂PO₄ 0.154g/L，pH 7.2～7.4。