[發(fā)明專利]發(fā)酵液中豬肌紅蛋白的分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110558529.5
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113150120B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設計）人: 趙鑫銳;張博涵;周景文;堵國成;李江華;陳堅;錢源
• 申請（專利權）人: 江南大學;江蘇東匯生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;C12N1/16;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.從微生物發(fā)酵液中分離純化豬肌紅蛋白的方法，其特征在于，采用濃縮-陰離子交換法從發(fā)酵液中分離純化豬肌紅蛋白；

所述濃縮-陰離子交換法具體是：將得到的濃縮液利用Vivaflow 200切向流過濾膜包進一步濃縮，將得到的濃縮上清上樣到陰離子交換柱中，用10~15 mM，pH 9.0~10.0的Tris-HCl緩沖液進行平衡，再用1~2 M NaCl緩沖溶液進行梯度洗脫，收集洗脫濃度為20% NaCl的洗脫液，即為肌紅蛋白純品；所述陰離子交換柱采用重力柱；

所述發(fā)酵液為利用表達豬肌紅蛋白的重組畢赤酵母發(fā)酵得到的，所述豬肌紅蛋白的NCBI Reference Sequence為NP_999401.1；

所述豬肌紅蛋白通過添加硫酸銨進行濃縮；具體步驟為：向發(fā)酵上清中緩慢加入硫酸銨粉末并攪拌至硫酸銨濃度達到50%飽和度，于1~4℃靜置2 h；4℃，5000~10000 g離心25~35 min收集上清；向上清中加入硫酸銨粉末，至硫酸銨濃度達到70%，于1~4℃靜置過夜；5000~10000 g離心25~35 min收集沉淀；用10 mM、pH 9.20的Tris-HCl緩沖液將沉淀復溶得到濃縮液。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組畢赤酵母是以畢赤酵母X33為宿主表達豬肌紅蛋白；

所述發(fā)酵液的制備包括以下步驟：

（1）一級種子培養(yǎng)：將保存的所述重組畢赤酵母進行活化，在15~35℃，100~600 rpm的條件下培養(yǎng)16-18 h；

（2）二級種子培養(yǎng)：將一級種子液以體積比1~5%的量接種到種子培養(yǎng)基中，在15~35℃，100~600 rpm的條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀=6~8；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)，控制DO為20% ~40%，攪拌轉速200-800 rpm，通氣量0.5~2.5 VVM；

（4）發(fā)酵上清的制備：發(fā)酵至少84 h后，取發(fā)酵液離心去除菌體，上清液采用真空抽濾，并進行收集得到發(fā)酵液。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，利用膜包截取分子量大于10 kDa的肌紅蛋白。