[發明專利]發酵液中豬肌紅蛋白的分離純化方法

有效

• 申請號: 202110558529.5
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113150120B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 趙鑫銳;張博涵;周景文;堵國成;李江華;陳堅;錢源
• 申請（專利權）人: 江南大學;江蘇東匯生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;C12N1/16;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了發酵液中豬肌紅蛋白的分離純化方法，屬于生物技術領域。本發明通過在發酵液中創造性地分步添加不同濃度的硫酸銨，對表達豬肌紅蛋白的重組畢赤酵母的發酵液進行濃縮，并對其進一步超濾濃縮，并對濃縮液進行純化得到的肌紅蛋白純度達88.04％，純化率可達66.05％，實現了從發酵液中純化豬肌紅蛋白，解決了之前豬肌紅蛋白發酵液難以純化的問題，并實現了豬肌紅蛋白發酵液的高效純化。本發明的分離純化方法特異性高，操作條件溫和，步驟簡潔，純化效果好，回收率高，成本低，速度快，益于擴大生產。

技術領域

本發明涉及發酵液中豬肌紅蛋白的分離純化方法，屬于生物技術領域。

背景技術

肌紅蛋白是一種單亞基血紅素蛋白，存在于一些無脊椎動物的肌肉中，也存在于大多數脊椎動物的心肌和骨骼肌中。在肌肉組織肌漿中肌紅蛋白能可逆地與氧結合，具有轉運和儲存氧的作用，賦予了肌肉組織鮮紅的顏色。近年來，隨著人造肉技術的發展，肌紅蛋白的添加可以使得人造肉制品更逼真地模擬真肉的顏色。

目前從發酵液中分離純化蛋白通常有親和層析、離子交換層析以及凝膠過濾層析，且大多依托于AKTA蛋白純化儀。在大多報道中，最常用的是親和層析中的His標簽純化，使目的蛋白與鎳離子結合，后用咪唑洗脫，從而進行純化。通常用于酶制劑的任何純化標簽都不能用于食品加工，所以不能采用His標簽進行純化。因而無法將常用的蛋白純化方法直接應用于分離食品級的蛋白。

蛋白的純化，首先得解決發酵液濃縮的問題。在利用畢赤酵母重組菌發酵生產豬肌紅蛋白的時候，發酵液含有消泡劑，而消泡劑會對大多數的超濾膜造成不可逆的溶解反應，導致目的蛋白無法達到濃縮的目的。其次得解決蛋白降解的問題，豬肌紅蛋白容易降解，以及工業化大規模純化生產的問題。

發明內容

為了解決目前利用重組畢赤酵母發酵得到的發酵液，發酵液的分離和純化存在的問題，本發明對分離和純化工藝做了創造性的改進。針對發酵液濃縮的問題，本發明涉及的發酵液含有消泡劑，消泡劑會對大多數的超濾膜造成不可逆的溶解反應，導致目的蛋白無法達到濃縮的目的。因此超濾杯不適合用于豬肌紅蛋白的濃縮。鹽析雖然能夠達到濃縮發酵液的目的，但是由于鹽析的過程中會造成一定的損失，因此不適合處理大量的發酵液。此外，嘗試了使用Vivaflow 200超濾膜包對豬肌紅蛋白進行濃縮，該方法能夠快速濃縮發酵液，并且有效避免蛋白的損失。為了對豬肌紅蛋白進行高效純化，本專利嘗試了三種沒有親和標簽的食品級純化方法。主要可以分為以下三種：鹽析-脫鹽-凝膠過濾層析(AKTA)，鹽析-脫鹽-DEAE陰離子交換層析(AKTA)，超濾濃縮-Q陰離子交換層析(重力柱)。但是AKTA蛋白純化儀的處理量低、純化效率低，因此不適合于大規模的工業生產。重力柱的使用，可以提高純化處理量，減少純化時間，避免豬肌紅蛋白的降解。超濾濃縮-Q陰離子交換層析(重力柱)具有操作簡便，成本低，純化率高等優點，可用于大規模工業生產。

本發明的第一個目的是提供從微生物發酵液中分離純化豬肌紅蛋白的方法，所述方法是利用如(a)～(c)任一所述方法從發酵液中分離純化豬肌紅蛋白；

(a)鹽析-脫鹽-陰離子交換法；

(b)鹽析-脫鹽-凝膠過濾層析法；

(c)濃縮-陰離子交換法；

所述發酵液為利用表達豬肌紅蛋白的重組畢赤酵母發酵得到的，所述豬肌紅蛋白的NCBI Reference Sequence為NP_999401.1。

在一種實施方式中，所述重組畢赤酵母是以畢赤酵母X33為宿主表達豬肌紅蛋白；

所述發酵液的制備包括以下步驟：

(1)一級種子培養：將保存的所述重組畢赤酵母進行活化，在15～35℃，100～600rpm的條件下培養16-18h；