[發明專利]一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110556410.4
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113248627B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 許發芝;朱正萱;孫菁;劉雪蘭
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/62;A61K39/215;A61K47/68;A61P31/14;A61P37/04
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺

本發明涉及動物免疫學技術領域，尤其涉及一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原及其制備方法和應用。該抗原為豬流行性腹瀉病毒COE結構域與雙載體Fc?Ii融合蛋白，即Fc?COE?Ii融合蛋白。本發明構建串聯小鼠IgG Fc和Ii的雙載體(Fc?Ii)，利用FcRn介導IgG Fc跨越黏膜屏障進入體內和Ii促進抗原的遞呈，從而更加有效的激發機體的局部粘膜免疫和全身性免疫反應。為開發新的豬流行性腹瀉疫苗提供了理論依據并奠定了良好的基礎，為新型粘膜疫苗的研制也提供了一種新的策略。

技術領域

本發明涉及動物免疫學領域，尤其涉及一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原及其制備方法和應用。

技術背景

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種接觸性腸道傳染病，是導致世界各養豬國家仔豬早期死亡的重要疫病。該病特點是水樣腹瀉、脫水、嘔吐，哺乳仔豬發病率可達到100％，大規模爆發后仔豬死亡率高達90％，在亞洲、歐洲和美國的養豬場均有發生。

PED作為一種高傳染性腸道疫病，國內外主要針對PEDV滅活苗或弱毒苗進行了研究，但免疫保護效果不佳。因缺乏有效的疫苗，該病仍在世界范圍內發生，給國內外養豬業造成了巨大的經濟損失。

黏膜是許多病原菌進入機體的首要門戶，要防止傳染病從黏膜表面進入機體，必須誘導黏膜和全身的免疫反應，以應對早期感染和病原體的傳播。黏膜上皮細胞和固有層內的免疫效應細胞之間的密切聯系表明，通過黏膜表面輸送免疫原是實現黏膜免疫和潛在的全身免疫的理想途徑。

豬流行性腹瀉病毒可以通過呼吸道黏膜表面感染機體，但目前仍缺乏可以抵御這種通過黏膜侵入機體的病原體的高效疫苗，如何通過疫苗引起豬機體的局部黏膜免疫和全身性免疫反應，降低豬流行性腹瀉的發病率，是現有技術亟待解決的問題。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的之一是提供一種用于增強豬流行性腹瀉免疫的抗原，通過雙載體Fc-Ii介導抗原結構域，可以增強接種豬產生特異性免疫應答，從而為研制出新型的PEDV疫苗奠定基礎。

所述用于增強豬流行性腹瀉免疫的抗原為豬流行性腹瀉病毒COE結構域與雙載體Fc-Ii融合蛋白，即Fc-COE-Ii融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

優選的，所述Fc-COE-Ii融合蛋白由pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒經感受態細胞表達得到，所述pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。

本發明的另一目的在于提供一種制備上述用于增強豬流行性腹瀉免疫的抗原的方法，包括如下步驟：

S1.分別提取鼠脾臟組織和豬腸道流行性腹瀉病料組織樣品的總RNA，并分別進行總RNA反轉錄得到cDNA，備用；

S2.通過PCR方法利用S1中cDNA擴增得到PEDV COE基因片段與小鼠 IgG Fc基因片段，測序確證；

S3.將PEDV COE基因片段與小鼠IgG Fc基因片段和pM-cherry-N1-Ii質粒串聯，構建pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒；

S4.將pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒轉化進感受態細胞中，所述感受態細胞為大腸桿菌BL21(DE3)菌種，利用大腸桿菌表達系統表達Fc-COE-Ii融合蛋白，該Fc-COE-Ii融合蛋白即為所需抗原。

優選的，所述S2中PCR為：以小鼠IgG2a重鏈基因序列設計一對Fc引物，引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，以豬流行性腹瀉病毒S基因序列設計一對COE引物，COE引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，利用所述Fc引物和COE引物對S1得到的cDNA進行擴增。