[發明專利]一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原及其制備方法和應用有效
| 申請號： | 202110556410.4 | 申請日： | 2021-05-21 |
| 公開（公告）號： | CN113248627B | 公開（公告）日： | 2022-07-15 |
| 發明（設計）人： | 許發芝;朱正萱;孫菁;劉雪蘭 | 申請（專利權）人： | 安徽農業大學 |
| 主分類號： | C07K19/00 | 分類號： | C07K19/00;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/62;A61K39/215;A61K47/68;A61P31/14;A61P37/04 |
| 代理公司： | 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118 | 代理人： | 王挺 |
| 地址： | 230036 安徽*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 增強 流行性 腹瀉 免疫 抗原 及其 制備 方法 應用 | ||
1.一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原，其特征在于，該抗原為豬流行性腹瀉病毒COE結構域與雙載體Fc-Ii融合蛋白，即Fc-COE-Ii融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權利要求1所述的一種增強豬流行性腹瀉免疫的抗原，其特征在于，所述Fc-COE-Ii融合蛋白由pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒經感受態細胞表達得到，所述pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一種制備如權利要求1所述的抗原的方法，其特征在于，包括如下步驟：
S1.分別提取鼠脾臟組織和豬腸道流行性腹瀉病料組織樣品的總RNA，并分別進行總RNA反轉錄得到cDNA，備用；
S2. 通過PCR方法利用S1中cDNA擴增得到PEDV COE基因片段與小鼠IgG Fc基因片段，測序確認；
所述PCR為：以小鼠IgG2a重鏈基因序列設計一對Fc引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，以豬流行性腹瀉病毒S基因序列設計一對COE引物，COE引物序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示，利用所述Fc引物和COE引物對S1得到的cDNA進行擴增；對擴增產物先進行瓊脂糖凝膠檢測，再對含目的基因片段的膠回收，回收后的膠經DNA純化柱離心、洗脫后，得到所述PEDV COE基因片段與小鼠IgG Fc基因片段；
S3. 將PEDV COE基因片段、小鼠IgG Fc基因片段和pM-cherry-N1-Ii質粒串聯，構建pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒；
具體步驟為：
S31. 利用含有Linker特異性引物Fc-up/Fc-down擴增得到Fc-Linker片段，利用含有Linker特異性引物COE-up/COE-down擴增得到Linker-COE片段；
S32. 以Fc-Linker片段與Linker-COE片段為模板，Fc-up和COE-down為引物，經PCR擴增得到Fc-COE基因；
S33. 將擴增的Fc-COE基因片段和pET-32a原核表達載體分別利用
S34. 以pET-32a-Fc-COE和pM-cherry-N1-Ii質粒為模版，以含有Linker 1特異性引物Fc-COE-up/Fc-COE-down擴增得到Fc-COE-Linker片段，以含有Linker 2特異性引物Ii-up/Ii-down擴增得到Linker-Ii片段；
S35. 以Fc-COE-Linker片段與Linker-Ii片段為模板，以Fc-COE-up和Ii-down為引物，經PCR擴增后，得到Fc-COE-Ii基因片段；
S36. 利用
所述Linker 1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Linker 2的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，所述連接均使用Ligation high Ver.2試劑16℃金屬浴連接；
所述特異性引物Fc-up/Fc-down的序列如SEQ ID NO.9/ SEQ ID NO.10所示；所述特異性引物COE-up/COE-down的序列如SEQ ID NO.11/ SEQ ID NO.12所示；所述特異性引物Fc-COE-up/Fc-COE-down的序列如SEQ ID NO.13/ SEQ ID NO.14所示；所述特異性引物Ii-up/Ii-down的序列如SEQ ID NO.15/ SEQ ID NO.16所示；
S4. 將pET-32a-Fc-COE-Ii重組質粒轉化進感受態細胞中，所述感受態細胞為大腸桿菌BL21(DE3)菌種，利用大腸桿菌表達系統表達Fc-COE-Ii融合蛋白，該Fc-COE-Ii融合蛋白即為所需抗原。
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