[發明專利]融合蛋白及靶向CD19的CAR及其應用

在審

• 申請號: 202110556149.8
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113698491A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 陳軍;沈俊杰;徐艷敏;楊智;洪娟;梅恩典;趙永春;趙文旭;黃霞;齊亞男
• 申請（專利權）人: 重慶精準生物技術有限公司;重慶精準生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發明屬于腫瘤細胞免疫治療技術領域，具體涉及一種融合蛋白及其靶向CD19的CAR及其應用。所述融合蛋白為SIRPγ融合蛋白，包含胞外段、跨膜結構和胞內信號區。該融合蛋白和靶向CD19的CAR結構連接共同或單獨轉染免疫細胞,該免疫細胞在缺氧環境下活性增強，而且以逆轉腫瘤微環境，破除腫瘤組織中抑制性信號對CAR?T功能的影響，實現了CAR?T治療有效性，同時能夠保證一定的安全性。

技術領域

本發明屬于腫瘤細胞免疫治療技術領域，具體涉及一種融合蛋白及靶向CD19的CAR及其應用。

背景技術

CAR-T全稱是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，嵌合抗原受體(chimeric antigenreceptor，CAR)是模擬TCR功能的人工受體，由抗原識別域、鉸鏈區和跨膜區及胞內信號域依次連接組成，胞內信號域通常為CD3ζ鏈或FcRγ，或與一種或多種共刺激分子相連，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv對腫瘤抗原具有特異性識別的特點，通過鉸鏈區和跨膜區進行T細胞激活細胞傳遞。目前臨床上CAR-T治療主要運用于血液瘤系統的腫瘤治療。

CAR-T療法雖然在血液系統瘤中取得較好的成績，但CAR-T在實體瘤中的效果不如血液系統瘤，其原因一方面因為CAR-T較難進入實體瘤內部，一方面即便CAR-T細胞進入實體瘤內部也因為腫瘤微環境而不能正常發揮功能，這些都影響CAR-T細胞在實體瘤治療的療效；并且由于實體瘤異質程度高，實體瘤靶點往往在正常組織也有所表達，因此還存在脫靶風險等安全問題。雖然目前有構建第四代CAR、有構建雙CAR(構建帶有雙抗原的CAR-T)或帶有激活抑制功能的iCAR的結構以期望提高腫瘤CAR-T治療的有效性和安全性，但這些CAR結構仍存在安全性或較難被激活的問題。總之CAR-T療法目前較多研究為血液瘤治療，實體瘤微環境較為復雜，如腫瘤微環境、腫瘤異質性等特點，使CAR-T療法的應用受到局限，因此，構建一種在腫瘤微環境中特異啟動活化的CAR結構很有必要。酸性和缺氧是腫瘤微環境中的兩大物理因素，腫瘤中的大部分的細胞都處在缺氧的環境中，而缺氧改變了腫瘤細胞的糖代謝途徑，產生大量的乳酸，造成腫瘤微環境中酸性的特征，而這些酸性可以降低腫瘤細胞凋亡，增強細胞的增殖和生長，并且幫助腫瘤細胞的遷移。缺氧在實體瘤微環境研究比較清楚，如果可以設計在缺氧條件下被激活的可調控啟動子，就可以達到在腫瘤微環境中特異性激活下游蛋白的表達從而提高CAR-T細胞的有效性和安全性的目的。另外信號調節蛋白α(SIRPα)是CD47的配體之一，可與CD47結合，抑制巨噬細胞的吞噬作用，目前絕大多數關于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可與CD47結合，其存在于T細胞表面，胞外區由一個V結構域和兩個C1結構域組成，無胞內信號，僅通過CD47傳遞單向信號，目前很少有研究者針對SIRPγ進行改造，并且CD47作為繼PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫檢查點，通過向巨噬細胞傳遞“不要吃我”信號，抑制固有免疫的進行。目前有文獻報道采用靶向CD47 ScFv制備CAR-T進行腫瘤治療。CD47可以促成腫瘤逃逸的免疫微環境，不過由于腫瘤的異質性，單獨靶向CD47療效有限，并且外源的ScFv由于其強的親和力可能會導致CAR-T細胞過度活化存續性差和非特異性引起安全隱患。因此，采用更安全有效的方案去識別CD47破除腫瘤微環境的逃逸信號十分重要。

CD19是B細胞表面的跨膜蛋白(Cluster of differentiation 19protein，CD19)，它與B細胞活化、信號傳導及生長調節密切相關，是B淋巴細胞表面特異性表達的一種功能受體分子，參與B細胞抗原受體(BCR)識別抗原和B細胞內Ca2+的轉運，調節B細胞的活化與增殖。CD19作為重要的分子標記物，可用于白血病、淋巴瘤及免疫系統疾病的診斷和預后判斷。CD19作為靶點的治療有效性好，安全性高。已有多項臨床研究，探索利用CAR-T治療CD19陽性B細胞惡性腫瘤。但是由于腫瘤微環境的影響，CAR-T在實體瘤的治療效果有限。雖然目前靶向CD19的CAR-T制品在治療淋巴細胞白血病上效果顯著，但在治療淋巴瘤上效果有限，構建一種針對腫瘤微環境的CAR-T細胞制品用于淋巴瘤的治療很有必要。

發明內容