[發明專利]融合蛋白及靶向CD19的CAR及其應用

在審

• 申請號: 202110556149.8
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113698491A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 陳軍;沈俊杰;徐艷敏;楊智;洪娟;梅恩典;趙永春;趙文旭;黃霞;齊亞男
• 申請（專利權）人: 重慶精準生物技術有限公司;重慶精準生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

1.一種逆轉腫瘤微環境的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白結構包含胞外段、跨膜結構和胞內信號區，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO:5或其功能性變體所示；優選地，所述跨膜結構來源于人CD28跨膜區或人CD8來源跨膜區；優選地，所述跨膜結構氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或其功能性變體；或如SEQ ID NO:4所示或其功能性變體。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白的結構為SIRPγ-CD28TM-CD28或SIRPγ-CD8TM-4-1BB；優選地，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示或其功能性變體；或所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示或其功能性變體。

3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，編碼所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；或編碼所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

4.包含權利要求1-3任一項所述的融合蛋白的表達載體。

5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為慢病毒表達載體、逆轉錄病毒表達載體、腺病毒表達載體、腺相關病毒表達載體、DNA載體，RNA載體中的任一種。

6.包含權利要求5所述的表達載體的免疫細胞。

7.根據權利要求6所述的免疫細胞，所述免疫細胞是T細胞、T細胞前體或NK細胞。

8.根據權利要求7所述的免疫細胞，其特征在于，包含具有識別腫瘤抗原的嵌合抗原受體結構，所述嵌合抗原受體包含識別腫瘤抗原的胞外段、hinge區、跨膜區和胞內信號區，所述腫瘤抗原為CD19。

9.一種腫瘤免疫抑制抵抗型CAR，其特征在于，所述腫瘤免疫抑制抵抗型CAR包括權利要求1-3任一所述的融合蛋白和CAR結構a；所述CAR結構a包括CD19單鏈抗體、CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、CD137和CD3ξ雙刺激信號；優選地，所述CAR結構a氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或其功能性變體；更優選地，所述CAR結構還包括缺氧啟動子，所述缺氧可調控啟動子的核酸序列包含如SEQ ID NO：2所示的序列。

10.核酸序列，其特征在于，編碼權利要求9所述的腫瘤免疫抑制抵抗型CAR，其特征在于，所述腫瘤免疫抑制抵抗型CAR，不包含缺氧啟動子，其包含如SEQ ID NO：10所示的序列；或所述免疫細胞中包含缺氧啟動子，其包含如SEQ ID NO：11所示的序列。

11.包含權利要求10所述核酸序列的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒還包括表達載體，所述表達載體為慢病毒表達載體、逆轉錄病毒表達載體、腺病毒表達載體、腺相關病毒表達載體、DNA載體，RNA載體中的任一種。

12.一種制備如權利要求8所述的免疫細胞的方法，其特征在于,將不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR結構和所述SIRPγ融合蛋白共同表達于一個載體轉染免疫細胞；或將不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR結構和所述SIRPγ融合蛋白分別表達于兩個載體轉染免疫細胞。

13.一種提高缺氧環境下CAR-T細胞殺傷能力的方法，其特征在于，構建一種包含權利要求11所述的重組質粒并感染T淋巴細胞，然后作用于靶細胞。