[發(fā)明專利]融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110556140.7
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113698489A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪娟;沈俊杰;楊智;黃霞;趙永春;趙文旭;陳軍;徐艷敏;齊亞男;梅恩典
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶精準生物技術(shù)有限公司;重慶精準生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于腫瘤細胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其應(yīng)用。所述融合蛋白為SIRPγ融合蛋白，包含胞外段、跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號區(qū)。該融合蛋白和靶向PSCA的CAR結(jié)構(gòu)連接共同或單獨轉(zhuǎn)染免疫細胞,該免疫細胞在缺氧環(huán)境下活性增強，而且以逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境，破除腫瘤組織中抑制性信號對CAR?T功能的影響，實現(xiàn)了CAR?T治療有效性，同時能夠保證一定的安全性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤細胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CAR-T全稱是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，嵌合抗原受體(chimeric antigenreceptor，CAR)是模擬TCR功能的人工受體，由抗原識別域、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號域依次連接組成，胞內(nèi)信號域通常為CD3ζ鏈或FcRγ，或與一種或多種共刺激分子相連，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv對腫瘤抗原具有特異性識別的特點，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)進行T細胞激活細胞傳遞。目前臨床上CAR-T治療主要運用于血液瘤系統(tǒng)的腫瘤治療。

CD47作為繼PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫檢查點，通過向巨噬細胞傳遞“不要吃我”信號，抑制固有免疫的進行。目前有文獻報道采用靶向CD47 ScFv制備CAR-T進行腫瘤治療。CD47可以促成腫瘤逃逸的免疫微環(huán)境，不過由于腫瘤的異質(zhì)性，單獨靶向CD47療效有限，并且外源的ScFv由于其強的親和力可能會導致CAR-T細胞過度活化存續(xù)性差和非特異性引起安全隱患。因此，采用更安全有效的方案去識別CD47破除腫瘤微環(huán)境的逃逸信號十分重要。信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)是CD47的配體之一，可與CD47結(jié)合，抑制巨噬細胞的吞噬作用，目前絕大多數(shù)關(guān)于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可與CD47結(jié)合，其存在于T細胞表面，胞外區(qū)由一個V結(jié)構(gòu)域和兩個C1結(jié)構(gòu)域組成，無胞內(nèi)信號，僅通過CD47傳遞單向信號，目前很少有研究者針對SIRPγ進行改造，而我們認為其是更適合進行針對CD47進行腫瘤微環(huán)境破除的配體。因此，我們選擇SIRPγ蛋白的胞外段進行改造設(shè)計，并進一步設(shè)計腫瘤免疫抑制抵抗型的CAR，并且CD47作為繼PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫檢查點，通過向巨噬細胞傳遞“不要吃我”信號，抑制固有免疫的進行。目前有文獻報道采用靶向CD47ScFv制備CAR-T進行腫瘤治療。CD47可以促成腫瘤逃逸的免疫微環(huán)境，不過由于腫瘤的異質(zhì)性，單獨靶向CD47療效有限，并且外源的ScFv由于其強的親和力可能會導致CAR-T細胞過度活化存續(xù)性差和非特異性引起安全隱患。因此，采用更安全有效的方案去識別CD47破除腫瘤微環(huán)境的逃逸信號十分重要。

前列腺干細胞抗原(PSCA)是最早發(fā)現(xiàn)于前列腺癌的GPI錨定的細胞膜蛋白,PSCA在前列腺癌,胰腺癌,膀胱癌等腫瘤中表達增加,相反在食管癌和胃癌中表達降低可能在胃上皮中發(fā)揮腫瘤抑制功能,PSCA發(fā)揮致瘤和抑瘤兩種截然不同的作用與細胞所處的環(huán)境不同有關(guān)。除此之外,PSCA作為腫瘤的免疫治療的靶點也顯示出其良好的臨床應(yīng)用潛力。因此PSCA不僅成為腫瘤診斷和預后判斷的生物學標記也是腫瘤免疫治療重要的候選靶蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明在于提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的融合蛋白，其與靶向PSCA的CAR結(jié)構(gòu)a構(gòu)成一種含有該融合蛋白的免疫細胞，該免疫細胞可以靶向殺傷CD47陽性的的腫瘤細胞；破除腫瘤組織中抑制性信號對免疫細胞功能的影響，實現(xiàn)了CAR-T治療有效性，同時能夠保證一定的安全性，其中含有融合蛋白的免疫細胞與不含有融合蛋白的免疫細胞相比較，含有融合蛋白的免疫細胞的體內(nèi)存續(xù)時間會更長并且安全性更高。。

進一步，所述融合蛋白為SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白結(jié)構(gòu)包含胞外段、跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號區(qū)，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO:5或其功能性變體所示；優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)構(gòu)來源于人CD28跨膜區(qū)或人CD8來源跨膜區(qū)；優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)構(gòu)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或其功能性變體；或如SEQ ID NO:4所示或其功能性變體。