[發(fā)明專利]利用基因工程菌和酵母耦合發(fā)酵大規(guī)模產CMP-唾液酸的方法

在審

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• 申請日: 2021-05-20
• 公開（公告）號: CN113881737A
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發(fā)明（設計）人: 張洪濤;游星;周文;黎玉;詹曉北
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P39/00;C12N1/19;C12R1/865;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了利用基因工程菌和酵母耦合發(fā)酵大規(guī)模產CMP?唾液酸的方法，屬于發(fā)酵工程技術。本發(fā)明以工業(yè)化大腸桿菌為基礎，在大腸桿菌中異源表達了CMP?唾液酸酶Neu5Ac，構建得到了基因工程菌株，將構建得到的任一種株工程菌和酵母進行混合發(fā)酵，以CMP和唾液酸為底物，從而合成CMP?唾液酸，為酸性母乳寡糖—唾液酸化寡糖的唾液酸化步驟工業(yè)化生產提供一條可行途徑，不僅得率高，而且價格低廉，打破由于CMP?唾液酸價格昂貴，而難以大量合成唾液酸基寡糖的瓶頸問題。在發(fā)酵罐條件下反應4h，CMP?唾液酸的產量可高達24.5g/L，具有明顯社會效益，市場前景廣闊。

技術領域

本發(fā)明涉及利用基因工程菌和酵母耦合發(fā)酵大規(guī)模產CMP-唾液酸的方法，屬于發(fā)酵工程技術。

背景技術

HMO(Human milk oligosaccharides)是人乳中含有的所有低聚糖的統(tǒng)稱，也叫人乳寡糖，是母乳中僅次于乳糖的第二大類碳水化合物成分和第三大營養(yǎng)成分，占母乳干物質的10％。目前，HMO已經被鑒定出來的種類高達200余種，HMO可分為三種主要的類型：(1)A.巖藻糖基化的中性HMO占總量的35～50％，代表物質2'-巖藻糖基半乳糖(2'-FL)是所有HMO中含量最高的，占近30％；(2)非巖藻糖基的中性HMO，占總量的42～55％，代表物質乳糖-N-新四糖(LNnT)；(3).唾液酸化的酸性HMO。占總量的12～14％，分為3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)。其中3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)表現(xiàn)出了極好的營養(yǎng)品質，目前科學家們都在研究如何高效的合成3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)。尤其是最近報告雙唾液酸化修飾的DSLNT具有降低嬰兒腸炎的發(fā)生，使得母乳寡糖中唾液酸基寡糖的合成成為一個新的關注領域。

合成唾液酸乳糖的方法主要有化學合成法和生物合成法，由于化學合成法涉及到繁瑣的保護和去保護步驟，不適合大規(guī)模生產，所以目前利用生物技術合成唾液酸乳糖成為最佳方案。唾液酸乳糖的合成需要將唾液酸活化為胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸(cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid，CMP-Neu5Ac)，然后CMP-Neu5Ac在唾液酸轉移酶的催化下，才實現(xiàn)唾液酸乳糖的合成。CMP-Neu5Ac其在細胞內的合成過程是：在CMP-Neu5Ac合成酶(NeuA)的催化下，1分子的CTP和1分子的N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)形成化學鍵，生成CMP-Neu5Ac。該過程是一個需要消耗大量CTP的過程。由于CTP價格昂貴(8000元/公斤)，造成作為唾液酸乳糖合成前體物質CMP-Neu5Ac不僅價格昂貴、并且不容易大量獲得，因此限制了唾液酸乳糖的產量。要想降低CMP-Neu5Ac價格，如何實現(xiàn)CTP的廉價合成成為關鍵。目前尚缺少有效的方法。

發(fā)明內容

為了解決目前唾液乳糖合成前體物質CMP-Neu5Ac價格昂貴、不易獲得，從而導致CTP生產成本高的問題，本發(fā)明構建了在大腸桿菌中異源表達了CMP-唾液酸酶Neu5Ac的基因工程菌，將基因工程菌與酵母加入含有CMP和Neu5Ac的反應體系中，構建了耦合發(fā)酵生產CMP-Neu5Ac的方法，實現(xiàn)了CMP-Neu5Ac的高效生產，并降低了生產成本。

本發(fā)明提供了一種生產CMP-Neu5Ac的方法，所述方法是利用表達CMP-唾液酸合成酶的基因工程菌株和酵母耦合發(fā)酵合成CMP-Neu5Ac。

在一種實施方式中，所述CMP-唾液酸合成酶來源于Neisseria meningitidisM0579、Neisseria meningitidis strain M22819、Pasteurella multocida ATCC43137、Haemophillus ducreyi 35000HP。