[發明專利]一種檢測病原微生物的方法及試劑盒在審

申請號：	202110550261.0	申請日：	2021-05-20
公開（公告）號：	CN113136420A	公開（公告）日：	2021-07-20
發明（設計）人：	郭文滸;薛怡婷;楊露;浦世珺	申請（專利權）人：	阿吉安（福州）基因醫學檢驗實驗室有限公司
主分類號：	C12Q1/686	分類號：	C12Q1/686
代理公司：	福州市博深專利事務所(普通合伙) 35214	代理人：	董晗
地址：	350108 福建省福州市***	國省代碼：	福建;35
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種檢測病原微生物方法試劑盒
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【說明書】：

本發明公開了一種檢測病原微生物的方法及試劑盒，屬于病原檢測技術領域，該試劑盒包括突變型的逆轉錄酶和突變型的Tn5轉座酶，該方法利用突變型的逆轉錄酶和突變型的Tn5轉座酶進行測序文庫構建，再經文庫純化和質檢后進行測序，分析結果后完成檢測。本發明提供的檢測病原微生物的試劑盒，突變型的逆轉錄酶和突變型的Tn5轉座酶的作用效率顯著提高，使得文庫構建所需的核酸量較一般市售試劑盒更低，最少取1ng的核酸即可進行準確檢測；本發明提供的檢測病原微生物的方法，最快2h即可完成檢測，大大縮短了檢測時間。

技術領域

本發明屬于病原檢測技術領域，具體涉及一種檢測病原微生物的方法及試劑盒。

背景技術

感染性疾病是臨床常見疾病之一，多數感染性疾病是由特定的病原體引起，例如細菌、病毒、真菌、寄生蟲。患者常出現局部或全身性的炎癥及器官功能障礙，其中一些感染性疾病病程進展快，死亡率高。因此快速檢測出臨床樣本中的病原微生物對于感染性疾病的診斷治療具有重要的臨床意義。目前臨床的病原體檢測方法主要包括涂片鏡檢、分離培養、免疫學檢測等，這些方法普遍存在陽性率低、檢測周期長、操作繁瑣等問題。

隨著宏基因組測序方法的發展，宏基因組和宏轉錄組測序在病原體檢測方面的應用越來越廣泛。宏基因組和宏轉錄組測序是對特定環境樣本中的DNA和RNA進行高通量測序，能夠在短時間內準確、高效地得到整個病原體群體的基因組和轉錄組信息，該技術相比傳統方法更為靈敏，能夠獲取環境中豐度較低的病原體信息，進而在臨床診斷領域上多應用于感染類型診斷、耐藥基因鑒定和傳染病的預防和控制。

目前用于病原體檢測的方法以及用于病原體檢測的二代測序產品，多數只檢測DNA病原體，或者只檢測RNA病原體；若要同時檢測DNA病原體和RNA病原體，在構建文庫時需要分成DNA文庫和RNA文庫，檢測流程繁雜，數據分析費時費力且檢測費用昂貴，臨床上難以推廣。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺陷，本發明所要解決的技術問題是：提供一種能夠同時且快速對DNA和RNA進行檢測的方法及試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種檢測病原微生物的試劑盒，包括逆轉錄酶和Tn5轉座酶；

所述逆轉錄酶為突變型逆轉錄酶，所述突變型逆轉錄酶的突變位點為：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5轉座酶為突變型Tn5轉座酶，所述突變型Tn5轉座酶的突變位點為：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。

本發明采用的另一種技術方案為：一種檢測病原微生物的方法，包括以下步驟：

步驟1、提取樣本的DNA和RNA，然后加入無核酸酶水進行孵育；

步驟2、在步驟1所得孵育后的核酸中加入逆轉錄酶，使RNA逆轉錄，然后加入Tn5轉座酶進行片段化，片段化結束加入終止液停止片段化反應；

步驟3、對步驟2所得產物進行鏈置換、文庫富集、文庫純化和質檢后進行測序；

所述逆轉錄酶為突變型逆轉錄酶，所述突變型逆轉錄酶的突變位點為：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5轉座酶為突變型Tn5轉座酶，所述突變型Tn5轉座酶的突變位點為：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。