[發(fā)明專利]一種檢測(cè)病原微生物的方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110550261.0
• 申請(qǐng)日: 2021-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN113136420A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭文滸;薛怡婷;楊露;浦世珺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿吉安（福州）基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 福州市博深專利事務(wù)所(普通合伙) 35214
• 代理人: 董晗

1.一種檢測(cè)病原微生物的試劑盒，其特征在于，包括逆轉(zhuǎn)錄酶和Tn5轉(zhuǎn)座酶；

所述逆轉(zhuǎn)錄酶為突變型逆轉(zhuǎn)錄酶，所述突變型逆轉(zhuǎn)錄酶的突變位點(diǎn)為：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5轉(zhuǎn)座酶為突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的突變位點(diǎn)為：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)病原微生物的試劑盒，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)病原微生物的試劑盒，其特征在于，所述Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tn5轉(zhuǎn)座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)病原微生物的試劑盒，其特征在于，還包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、Tn5轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)液、引物、混合引物反應(yīng)液、高保真擴(kuò)增反應(yīng)液和高保真擴(kuò)增酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)病原微生物的試劑盒，其特征在于，還包括高保真擴(kuò)增反應(yīng)液，所述高保真擴(kuò)增反應(yīng)液包括0.1-5mmol/L的5-碘-2'-脫氧尿苷、0.05-10mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.01-0.05％的二甲基亞砜、0.005-0.01％的聚乙二醇和0.1-50mmol/L的檸檬酸二鈉。

6.一種檢測(cè)病原微生物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、提取樣本的DNA和RNA，然后加入無核酸酶水進(jìn)行孵育；

步驟2、在步驟1所得孵育后的核酸中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，使RNA逆轉(zhuǎn)錄，然后加入Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行片段化，片段化結(jié)束加入終止液停止片段化反應(yīng)；

步驟3、對(duì)步驟2所得產(chǎn)物進(jìn)行鏈置換、文庫富集、文庫純化和質(zhì)檢后進(jìn)行測(cè)序；

所述逆轉(zhuǎn)錄酶為突變型逆轉(zhuǎn)錄酶，所述突變型逆轉(zhuǎn)錄酶的突變位點(diǎn)為：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5轉(zhuǎn)座酶為突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的突變位點(diǎn)為：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)病原微生物的方法，其特征在于，所述鏈置換為：在步驟3所得產(chǎn)物中加入引物、高保真擴(kuò)增反應(yīng)液和高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行鏈置換，替換RNA鏈。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)病原微生物的方法，其特征在于，所述樣本為血漿、腦脊液、骨髓液、房水、胸腹水、關(guān)節(jié)積液、組織、尿液、膿腫抽液、肺泡灌洗液、痰液或鼻咽拭子。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)病原微生物的方法，其特征在于，所述步驟2中取1-5ng步驟1所得孵育后的核酸。