[發明專利]NGF作為用于治療食管癌的藥物及診斷試劑盒的應用

在審

• 申請號: 202110532519.4
• 申請日: 2021-05-17
• 公開（公告）號: CN113289021A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 王艷東;李慧
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61P35/00;G01N33/573;G01N33/574;C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12Q1/02
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.NGF作為治療食管癌藥物或診斷食管癌的試劑盒。

2.NGF作為治療食管癌藥物或診斷食管癌的試劑盒的應用，其特征在于包括以下步驟；

a.以NGF作為目標調控基因，構建干擾NGF基因的表達載體；

步驟b：利用步驟a中的載體，進行體外細胞實驗，食管癌細胞的增殖和遷移受到抑制；

步驟c：或者利用步驟a中的載體，進行Western Blot分析，AKT的磷酸化水平受到抑制；

步驟d：或者.利用步驟a中的載體，進行熒光定量PCR分析，NGF基因表達水平顯著下調，并且抑制與增殖和遷移相關的Cyclin D1及MMP2基因的表達水平。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述步驟a中，干擾NGF基因的表達載體為RNAi系統基因沉默載體，干擾NGF表達包括沉默NGF編碼基因，降低或抑制其轉錄為mRNA和翻譯為蛋白質的功能。

4.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述步驟b-d中，均需進行細胞轉染處理，所述細胞轉染試劑為Lipofectamine 2000，轉染后作用時間為24小時。

5.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述步驟b中，細胞增殖實驗為MTT實驗，MTT的作用時間為4小時，檢測波長為450nm。

6.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述步驟b中，細胞遷移實驗為細胞劃痕實驗。

7.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述步驟c中，所用一抗為P-AKT、AKT以及β-actin，其中P-AKT及AKT所用二抗為IgG羊抗兔，β-actin所用二抗為IgG羊抗鼠。

8.如權利要求1所述的NGF作為治療食管癌藥物和診斷試劑盒中的應用，其特征在于：所述步驟d中，熒光定量PCR分析中用SYBR Green I熒光染料法來定量mRNA的相對表達水平，以cDNA為模板，β-actin作為內參基因進行標準化校正；所述熒光定量PCR程序為：50℃2min；95℃10min，95℃1s，60℃1min，重復40個循環。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于：模板cDNA是通過對食管癌細胞進行轉染處理，24小時后使用Trizol試劑提取細胞總RNA，隨后利用Invitrogen反轉錄試劑盒進行逆轉錄得到。

10.如權利要求8所述的應用，其特征在于：β-actin的正向引物為：CCCTGGCACCCAGCAC，反向引物為：TGTCCGAATGTAGTGCTCCAC；NGF的正向引物為：TGTGGGTTGGGGATAAGACCA，反向引物為：GCTGTCAACGGGATTTGGGT；Cyclin D1的正向引物為：GATCAAGTGTGACCCGGAC，反向引物為CTTGGGGTCCATGTTCTGCT；MMP2的正向引物為GGACTTAGACCGCTTGGCTT，反向引物為：GTGTTCAGGTATTGCATGTGCT。