[發(fā)明專利]一種構(gòu)建復雜異質(zhì)組織/器官的多級懸浮打印方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110526251.3
• 申請日: 2021-05-14
• 公開（公告）號: CN113290844B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 熊卓;方永聰;張婷;郭依涵;郭昱江
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學
• 主分類號: B29C64/10
• 分類號: B29C64/10;B29C64/314;B29C64/379;B29C64/40;B33Y10/00;B33Y40/10;B33Y40/20;C12N5/00;B29L31/40
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

本發(fā)明公開了一種構(gòu)建復雜異質(zhì)組織/器官的多級懸浮打印方法。所述方法包括如下步驟：S1、制備生物墨水，生物墨水由已交聯(lián)的載細胞的凝膠微球形成，或由已交聯(lián)的載細胞的凝膠微球與一種或多種未交聯(lián)的凝膠材料混合得到；S2、在懸浮介質(zhì)中，打印生物墨水以構(gòu)建特定的組織/器官結(jié)構(gòu)；S3、在S2得到的組織/器官結(jié)構(gòu)內(nèi)部，進一步進行二級或多級的子結(jié)構(gòu)打印；S4、打印結(jié)束后，經(jīng)整體交聯(lián)后溶出懸浮介質(zhì)即得。本發(fā)明多級懸浮3D打印方法基于兼具剪切變稀和自愈合特性的凝膠微球墨水，可在懸浮介質(zhì)中打印成形，其后又可用作下一級結(jié)構(gòu)打印的懸浮介質(zhì)，適合于構(gòu)建出具有血管通道和異質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)的組織器官模型，有利于推動工程化組織/器官在再生修復治療方面的臨床應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建復雜異質(zhì)組織/器官的多級懸浮打印方法，屬于組織工程和生物制造技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

組織工程與再生醫(yī)學作為一門新興交叉學科，旨在體外構(gòu)建具有仿生結(jié)構(gòu)與功能的人工組織與器官，在組織器官再生修復、藥物開發(fā)與篩選、病理模型構(gòu)建等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，以膀胱、皮膚、軟骨和血管為代表的組織工程產(chǎn)品已經(jīng)得到初步應(yīng)用，然而，對于心臟和肝臟等復雜異質(zhì)組織/器官的體外構(gòu)建仍進展緩慢。

傳統(tǒng)的組織工程方法主要采用自上而下策略，以細胞-支架復合技術(shù)為代表，即通過細胞和多孔支架的復合直接構(gòu)建出結(jié)構(gòu)體，再通過細胞組裝、細胞外基質(zhì)重構(gòu)來誘導結(jié)構(gòu)體的功能成熟；然而，這種策略面臨著細胞分布不均勻、種植效率低和異質(zhì)細胞種植困難等挑戰(zhàn)，難以構(gòu)建復雜異質(zhì)組織與器官。近年來，隨著生物制造技術(shù)的迅猛發(fā)展，自下而上的組織器官構(gòu)建策略正逐漸成為主流。該策略以生物3D打印技術(shù)為代表，通過將含細胞的生物墨水按照預定義路徑，逐層堆積形成具有復雜結(jié)構(gòu)的組織與器官。其中，微擠出式打印方法由于材料適用范圍廣，成為目前主流的3D打印工藝。然而，由于水凝膠的力學性能較差，難以直接打印空殼、懸梁、卷曲等非自支撐式結(jié)構(gòu)，從而限制了其在復雜組織器官構(gòu)建上的應(yīng)用。

一種思路為水凝膠增強策略，即引入高強度的合成聚合物結(jié)構(gòu)，為載細胞的生物墨水的打印提供必要的支撐，以韓國Kang課題組的工作為代表(Kang,H.et al.A 3Dbioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structuralintegrity.Nature Biotechnology,2016,34,312-319.)。他們開發(fā)了復合細胞擠出式打印和熔融沉積成型技術(shù)的多噴頭打印設(shè)備，成功打印出下頜骨、耳軟骨和顱骨等組織。盡管這種水凝膠增強策略能夠為水凝膠提供結(jié)構(gòu)支持，同時能夠精確控制細胞沉積，然而，聚合物相對較低的打印精度(≈200μm)極大地限制了組織成熟的空間，同時較硬的聚合物材料并不適合于心臟等軟組織的構(gòu)建。

另一種思路為懸浮打印策略，即依靠懸浮介質(zhì)為打印結(jié)構(gòu)提供支撐，從而可實現(xiàn)高度復雜結(jié)構(gòu)的成形(McCormack,A.,Highley,C.B.,Leslie,N.R.Melchels,F.P.W.3Dprinting in suspension baths:keeping the promises of bioprintingafloat.Trends in Biotechnology,2020,38,584-593)。另外，懸浮打印可以使用如膠原、纖維蛋白等細胞外基質(zhì)材料的低粘度生物墨水，為組織器官的功能成熟提供了更適宜的微環(huán)境。如2019年以色列Tal Dvir課題組基于懸浮打印策略，采用脫細胞外基質(zhì)制備的生物墨水打印了含血管結(jié)構(gòu)的心臟模型(Noor,N.,et al.,3D Printing of personalizedthick and perfusable cardiac patches and hearts.Advanced Science,2019.6(11):p.190034.)；雖然該研究實現(xiàn)了多種墨水的懸浮打印，然而，難以構(gòu)建精度在百微米以下的結(jié)構(gòu)特征(如微血管和神經(jīng))，限制了其在復雜組織器官的仿生構(gòu)建方面的應(yīng)用。