[發(fā)明專利]一種構(gòu)建復(fù)雜異質(zhì)組織/器官的多級(jí)懸浮打印方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110526251.3
• 申請(qǐng)日: 2021-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113290844B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊卓;方永聰;張婷;郭依涵;郭昱江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): B29C64/10
• 分類號(hào): B29C64/10;B29C64/314;B29C64/379;B29C64/40;B33Y10/00;B33Y40/10;B33Y40/20;C12N5/00;B29L31/40
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

1.一種構(gòu)建具有復(fù)雜血管通道和異質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織/器官模型的多級(jí)懸浮打印方法，包括如下步驟：

S1、制備生物墨水，所述生物墨水由已交聯(lián)的載細(xì)胞的凝膠微球與一種或多種未交聯(lián)的凝膠材料混合得到，其中，所述載細(xì)胞的凝膠微球作為分散相，所述凝膠材料作為連續(xù)相；

S2、在懸浮介質(zhì)中，打印所述生物墨水以構(gòu)建特定的組織/器官結(jié)構(gòu)；

所述組織/器官結(jié)構(gòu)包括心臟、肝臟、腎臟、胰腺和腦結(jié)構(gòu)中至少一種；

所述組織/器官結(jié)構(gòu)的尺寸為500μm~100mm；

S3、在步驟S2得到的所述組織/器官結(jié)構(gòu)內(nèi)部，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)的子結(jié)構(gòu)打??；

按照下述1）和2）的方式打印所述二級(jí)和三級(jí)的子結(jié)構(gòu)：

1）采用載其他細(xì)胞的所述生物墨水打印特定的生理或病理結(jié)構(gòu)；

2）打印載血管生成細(xì)胞的犧牲墨水來(lái)構(gòu)建復(fù)雜血管通道，直徑為100μm~5mm；

步驟2）后還包括去除所述犧牲墨水的步驟；

去除所述犧牲墨水的方式為溫度變化、pH變化和離子作用中至少一種；

S4、打印結(jié)束后，經(jīng)整體交聯(lián)后溶出所述懸浮介質(zhì)，即得到具有復(fù)雜血管通道和異質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織/器官模型；

所述整體交聯(lián)的方法為光、溫度交聯(lián)、離子交聯(lián)、酶交聯(lián)和共價(jià)交聯(lián)方式中至少一種；

去除所述懸浮介質(zhì)的方法為溫度變化、搖晃、水洗、酶溶解等方式中至少一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多級(jí)懸浮打印方法，其特征在于：步驟S1中，按照下述方法制備所述載細(xì)胞的凝膠微球：

懸滴法培養(yǎng)、超低附著性培養(yǎng)板、磁力懸浮培養(yǎng)、動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和微流控技術(shù)中至少一種；

所述細(xì)胞為組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞、多能干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、血管生成細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中至少一種；

所述載細(xì)胞的凝膠微球內(nèi)細(xì)胞密度為10⁶/mL~10⁸/mL；

所述載細(xì)胞的凝膠微球內(nèi)凝膠材料的質(zhì)量-體積濃度為10~100mg/mL；

作為所述連續(xù)相的所述凝膠材料的質(zhì)量-體積濃度為1~100mg/mL；

作為所述連續(xù)相的所述凝膠材料可載有細(xì)胞；

所述凝膠材料內(nèi)細(xì)胞密度為10⁶/mL~5×10⁷/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多級(jí)懸浮打印方法，其特征在于：步驟S1中，所述載細(xì)胞的凝膠微球采用的凝膠與所述凝膠材料均為天然高分子水凝膠和/或合成高分子水凝膠；

所述天然高分子水凝膠材料為海藻酸鈉、明膠、膠原、基質(zhì)膠、殼聚糖、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、硫酸軟骨素、白蛋白以及它們的甲基丙烯?；a(chǎn)物中的至少一種；

所述合成高分子水凝膠材料為聚乙二醇、聚丙烯醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚磷腈、聚N-異丙基丙烯酰胺類水凝膠以及它們的甲基丙烯?；a(chǎn)物中的至少一種；

所述載細(xì)胞的凝膠微球的直徑為50μm~1000μm，在所述生物墨水中的體積含量為40%~100%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多級(jí)懸浮打印方法，其特征在于：步驟S2中，所述懸浮介質(zhì)為具有自愈合特性的水凝膠材料，具體為超分子自愈合水凝膠和/或微凝膠結(jié)構(gòu)；

所述超分子自愈合水凝膠為環(huán)糊精基超分子水凝膠、DNA超分子水凝膠、聚氨酯脲超分子水凝膠、透明質(zhì)酸-葡聚糖超分子水凝膠、丹參酮II-A多肽超分子水凝膠和石墨烯復(fù)合超分子水凝膠中至少一種；

所述微凝膠結(jié)構(gòu)的尺寸為1μm~50μm；

所述微凝膠結(jié)構(gòu)為卡波姆、明膠和海藻酸鈉中至少一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多級(jí)懸浮打印方法，其特征在于：所述卡波姆為以季戊四醇與丙烯酸交聯(lián)得到的丙烯酸交聯(lián)樹(shù)脂，溶劑為去離子水、PBS緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)基中至少一種；

所述明膠和所述海藻酸鈉采用高速攪拌工藝制備，轉(zhuǎn)速為1000~10，000轉(zhuǎn)每分鐘；

所述明膠通過(guò)明膠-阿拉伯膠的復(fù)合凝聚反應(yīng)制備。

6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建的具有復(fù)雜血管通道和異質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織/器官模型。