[發(fā)明專利]一種H5N1雙重?zé)晒舛繖z測(cè)試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110526001.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113308572A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 襲細(xì)毛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州博識(shí)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及一種H5N1雙重?zé)晒舛繖z測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：2×BIOG^HSCSuperMultiProbeMix，BIOG^HSCSuperEnzymeMix，H5?F、H5?R、N1?F、N1?R引物，H5?P、N1?P探針，RT?PCREnhancer，Rnase?freeddH₂O，50×ROXReferenceDye，Taq酶保護(hù)液，2×BIOG^HSCSuperProbeMastermix，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有H5和N1基因片段的線性質(zhì)粒，所述陰性對(duì)照為PBS，本發(fā)明的有益效果是提供了一種特異性、穩(wěn)定性、靈敏性都較好的用于檢測(cè)禽流感病毒H5N1亞型的檢測(cè)試劑盒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種H5N1雙重?zé)晒舛繖z測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

血凝素(HA)能與多種動(dòng)物包括人以及雞、豬等的紅細(xì)胞表面的唾液酸受體相結(jié)合，引起紅細(xì)胞發(fā)生凝集的現(xiàn)象，故而被稱作為血凝素，HA在病毒表面呈柱狀，由3 條糖基化多肽分子以非共價(jià)鍵的形式聚合形成三聚體，每個(gè)單體的原始肽鏈HA0必須經(jīng)過(guò)細(xì)胞的蛋白酶裂解后才能被活化，形成二硫鍵連接的C末端HA1重鏈以及N末端HA2輕鏈，病毒才可以感染細(xì)胞。HA1能夠與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體相結(jié)合，HA 2具有膜融合活性，是病毒感染時(shí)侵入細(xì)胞所必須的，HA1和HA2亞基蛋白之間的堿性氨基酸序列對(duì)流感病毒的組織親嗜性和致病力有著密切關(guān)系，高致病性流感病毒在H A的切割位點(diǎn)有多個(gè)堿性氨基酸，易被宿主細(xì)胞蛋白酶水解，而低致病性流感病毒的切割位點(diǎn)較少且不易被水解。此外，HA具有免疫原性，是流感病毒的重要中和抗原之一，表面有五個(gè)抗原決定簇，其抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變化，從而導(dǎo)致抗原性的改變，這成為甲型流感病毒亞型分類的主要依據(jù)。根據(jù)HA類型，禽流感病毒被劃分為H1-H18 HA亞型。

神經(jīng)氨酸酶(NA)是由4條結(jié)構(gòu)完全相同的糖基化多肽組合而成的一個(gè)在病毒表面呈蘑菇狀的四聚體糖蛋白，其中每?jī)蓚€(gè)多肽通過(guò)一個(gè)二硫鍵相互連接，每?jī)蓪?duì)多肽即四個(gè)多肽組成一個(gè)四聚體。每一個(gè)多肽由球形的頭部和細(xì)長(zhǎng)的頸部?jī)刹糠纸M成，頭部是 NA的活性部位，頸部則負(fù)責(zé)將蛋白錨定在病毒包膜表面，四聚體蛋白通過(guò)纖細(xì)的頸部與包膜連接。NA具有水解宿主細(xì)胞表面唾液酸的酶活性。當(dāng)成熟的流感病毒通過(guò)出芽的方式突出宿主細(xì)胞以后，病毒表面的HA會(huì)通過(guò)唾液酸受體與宿主細(xì)胞膜保持緊密聯(lián)系，使流感病毒無(wú)法立即脫離宿主細(xì)胞，這就需要NA將唾液酸水解，切斷病毒與宿主細(xì)胞膜之間的最后聯(lián)系，使病毒能夠順利的從宿主細(xì)胞膜釋放，繼而感染新的宿主細(xì)胞，因此NA成為流感藥物治療的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)，針對(duì)此酶設(shè)計(jì)了多種藥物，如奧司他韋是有效的抗流感藥物之一。NA同HA一樣也具有免疫原性，是流感病毒的重要的中和抗原之一，NA的抗原性易發(fā)生變異，這也成為劃分甲型流感病毒亞型分類的另一個(gè)主要依據(jù)，根據(jù)NA的類型，禽流感病毒被劃分為N1-N11 NA亞型。

熒光定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reversetranscription po lymerase chain reactin，RT-PCR)是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，成為定量的依據(jù)。Taqman探針?lè)ㄊ菬晒舛縋CR的一種，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號(hào)，特異性比染料法高，缺點(diǎn)是成本高。TaqMan探針的基本原理是利用擴(kuò)增過(guò)程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切割與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針，該探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基因，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)并被磷酸化以防止探針在P CR過(guò)程中延伸，當(dāng)引物延伸至寡核苷酸結(jié)合位置時(shí)，Taq酶可以將其切割成小片段，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)并發(fā)出熒光，經(jīng)過(guò)檢測(cè)伴隨擴(kuò)增產(chǎn)物增加過(guò)程中熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)對(duì)樣本進(jìn)行定量分析。TaqMan探針的設(shè)計(jì)，既要保證特異性又要滿足有效和高效地?cái)U(kuò)增，同時(shí)需要解決單管多通道檢測(cè)時(shí)通道間的信號(hào)干擾問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供特異性、穩(wěn)定性、靈敏性好的用于檢測(cè)禽流感病毒H5N1亞型的引物對(duì)、探針以及試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：