[發明專利]一種H5N1雙重熒光定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110526001.X
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113308572A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 襲細毛
• 申請（專利權）人: 廣州博識生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種H5N1雙重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：2×BIOG^HSC Super MultiProbe Mix，BIOG^HSC Super Enzyme Mix，H5-F、H5-R、N1-F、N1-R引物，H5-P、N1-P探針，RT-PCR Enhancer，Rnase-free ddH₂O，50×ROX Refer ence Dye，Taq酶保護液，2×BIOG^HSC Super Probe Master mix，陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有H5和N1基因片段的線性質粒，所述陰性對照為PBS，所述的H5-F序列為：GGCAATAGATGGAGTCACCAATAA，H5-R序列為：CGGCCTCAAACTGAGTGTTCA，H5-P序列為：TCAACTCGATCATTGACAAA，N1-F序列為：ACGGCCAAATGACGGTACAG，N1-R序列為：TTTACCCCATATGCCCCGTTA，N1-P序列為：TTGTGGTCCAGTGTCCT。

2.一種H5N1雙重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，使用方法包括以下步驟：

①提取樣品RNA；

②配制熒光定量PCR反應體系，體系如下：

2×BIOG^HSC Super MultiProbe Mix 10μl，BIOG^HSC Super Enzyme Mix 0.5μl，RT-PCREnhancer 0.5μl，H5、N1上游引物(10μM)0.5μl，H5、N1下游引物(10μM)0.5μl，探針(20μM)0.5μl，Rnase-free ddH₂O 3.5μl，模板核酸4μl；

實時熒光定量PCR反應條件為：42℃20min，95℃10min，(95℃15s，60℃35s，72℃45s)共40個循環，72℃10min；

③用10倍梯度稀釋的含有H5、N1基因片段的線性質粒作為標準品進行實時熒光定量PCR，體系如下：

2×BIOG^HSC Super Probe Master Mix 10μl，H5、N1上游引物(10μM)0.5μl，H5、N1下游引物(10μM)0.5μl，線性質粒模板2μl，探針0.5μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，Taq酶保護液0.2μl，ddH₂O 5.9μl，反應程序為95℃10min，(95℃15s，60℃35s，72℃45s)共40個循環，72℃10min，以質粒拷貝數的Log值為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線，再將待檢樣品的實時熒光定量PCR檢測結果與標準曲線對照，得出檢測結果。