[發(fā)明專利]中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110525780.1
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113215275B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐念;闕延福;邵科;李偉濤;熊美華;田華;董微微;汪鄂洲;胡興坤
• 申請（專利權(quán)）人: 水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

1.一種適用于水體環(huán)境DNA擴(kuò)增的用于中華鱘檢測的引物，其特征在于：引物序列為：

正向引物ND2-F序列為：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列為：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’。

2.一種中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述的適用于水體環(huán)境DNA擴(kuò)增的用于中華鱘檢測的引物和熒光探針5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，熒光探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，其特征在于：還包括超敏微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，其特征在于：所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 60s，45個循環(huán)；98℃ 10min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，其特征在于：所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系每20μL反應(yīng)體系包括：超敏微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液5μL，正反向引物各1.8μL，正反向引物濃度10μM，探針0.5μL，探針濃度10μM，DNA模板2μL，ddH2O 8.9μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，其特征在于：PCR擴(kuò)增結(jié)果存在陽性微滴的樣本則為陽性樣本，表明該樣本中檢測到目標(biāo)DNA片段，該采樣點(diǎn)附近存在中華鱘繁殖群體分布；反應(yīng)體系拷貝數(shù)換算出的環(huán)境DNA濃度，單位copy/mL，表明水樣中目標(biāo)DNA的濃度。

7.中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）以提取的環(huán)境DNA為模板，使用權(quán)利要求2所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系進(jìn)行目的片段的數(shù)字PCR擴(kuò)增；

（2）擴(kuò)增完成后，將反應(yīng)板置于生物芯片閱讀儀中進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)分析軟件讀取結(jié)果，顯示反應(yīng)體系拷貝數(shù)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于：環(huán)境DNA的提取步驟如下：

（1）采集河流表層水樣；

（2）濾膜真空抽濾，富集目標(biāo)DNA載體，富集目標(biāo)DNA載體的濾膜保存直至DNA提??；

（3）用強(qiáng)力水樣DNA提取試劑盒提取得到濾膜DNA即環(huán)境DNA，用于PCR擴(kuò)增。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于：所述的步驟（1）中，采集多個監(jiān)測斷面的水樣進(jìn)行PCR檢測，由此可監(jiān)測目標(biāo)物種的分布范圍和群體動態(tài)；采集每個監(jiān)測斷面的水樣時，采集多個水樣；在同一斷面采集多個平行樣本有助于提高檢測率。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于：常溫保存的水樣在8小時內(nèi)完成抽濾，-4℃冷藏保存的水樣在24小時內(nèi)完成抽濾。