[發(fā)明專利]中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110525780.1
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113215275B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐念;闕延福;邵科;李偉濤;熊美華;田華;董微微;汪鄂洲;胡興坤
• 申請（專利權(quán)）人: 水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

本發(fā)明涉及中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法。以提取的環(huán)境DNA為模板，使用中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系進行目的片段的數(shù)字PCR擴增；擴增完成后，將反應(yīng)板置于生物芯片閱讀儀中進行檢測，數(shù)據(jù)分析軟件讀取結(jié)果，顯示反應(yīng)體系拷貝數(shù)。本發(fā)明可以定量檢測大型河流水樣中的中華鱘環(huán)境DNA，無需接觸魚類個體，對生物體無損傷，對環(huán)境無負面影響，采樣方法簡單快捷，檢測體系靈敏度高，絕對定量準確度高。為大型河流中種群密度低的珍稀瀕危魚類中華鱘的群體監(jiān)測提供了高效、準確且非入侵式的調(diào)查方法，用于中華鱘聚集地調(diào)查和資源量動態(tài)監(jiān)測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法。

背景技術(shù)

中華鱘(Acipenser sinensis)是國家一級保護動物，種群嚴重衰退，自然繁殖已連續(xù)中斷4年(2017-2019年)，2020年葛洲壩下產(chǎn)卵場江段中華鱘繁殖群體數(shù)量僅十余尾。群體動態(tài)和繁殖行為監(jiān)測是中華鱘物種保護的基礎(chǔ)，僅依靠傳統(tǒng)調(diào)查方法難以獲取充足數(shù)據(jù)，且調(diào)查準確度亟待加強。長江環(huán)境DNA物種檢測技術(shù)近年來逐漸發(fā)展，通過采集水體樣本提取環(huán)境DNA，利用特定分子標(biāo)記進行水生生物檢測，具有無損傷、采樣簡單高效、檢測靈敏度高、物種鑒定準確等優(yōu)勢。用于組織DNA的常規(guī)引物通常目的片段較長，對部分降解的環(huán)境DNA難以擴增成功，研究開發(fā)針對目標(biāo)物種的特定位點，設(shè)計短片段擴增引物，篩選可穩(wěn)定擴增的分子標(biāo)記，并進一步地研究開發(fā)適用于中華鱘環(huán)境DNA的檢測方法具有重要的意義。

發(fā)明目的

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，設(shè)計篩選可靶定中華鱘線粒體DNA且適用于水體環(huán)境DNA擴增的引物和探針，建立高敏感度的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)擴增體系，提供一種快速高效的中華鱘環(huán)境DNA檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

提供一種適用于水體環(huán)境DNA擴增的用于中華鱘檢測的引物，引物序列為：

正向引物ND2-F序列為：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列為：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’。

提供一種中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系，包括上述適用于水體環(huán)境DNA擴增的用于中華鱘檢測的引物和熒光探針5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，熒光探針5’端標(biāo)記熒光報告基團，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團。

上述熒光報告基團具體可為FAM、VIC。

熒光淬滅基團具體可為MGB、BHQ₁。

按上述方案，上述中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系還包括超敏微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液。

按上述方案，所述的PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃10min；95℃30s，60℃60s，45個循環(huán)；98℃10min。

按上述方案，上述中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR體系每20μL反應(yīng)體系包括：超敏微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液5μL，正反向引物(10uM)各1.8μL，探針(10uM)0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O8.9μL。

按上述方案，步驟(2)中PCR擴增結(jié)果存在陽性微滴的樣本則為陽性樣本，表明該樣本中檢測到目標(biāo)DNA片段，該采樣點江段附近存在中華鱘繁殖群體分布；反應(yīng)體系拷貝數(shù)換算出的環(huán)境DNA濃度(copy/mL)，表明水樣中目標(biāo)DNA的濃度，進行PCR定量檢測。在采樣時間和環(huán)境條件相同的情況下，目標(biāo)環(huán)境DNA濃度與物種生物量相關(guān)，環(huán)境DNA濃度高，表明有更多個體在該區(qū)域分布。不同采樣時間或不同環(huán)境條件影響下，需綜合考慮其它影響因素來判斷群體分布和資源量。

提供中華鱘環(huán)境DNA數(shù)字PCR檢測方法，包括以下步驟：