[發明專利]一種肉瘤細胞培養基以及采用該培養基體外生產Matrigel原液的方法

有效

• 申請號: 202110525501.1
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113106066B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 游明亮;申重陽
• 申請（專利權）人: 杭州艾名醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/02;C12N11/10;C12N11/04
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 代維凡

本發明公開了一種肉瘤細胞培養基以及采用該培養基體外生產Matrigel原液的方法，肉瘤細胞培養基包括：DMEM/F12基礎培養基、1.5?2.5v/v％FBS、0.5?1.5v/v％ITS、丙酮酸鈉0.5?1.5mM、氫化可的松20?40nM、3?6ng/ml FGF2、EGF 40?60ng/ml和Hippo抑制劑。采用該培養基體外生產Matrigel原液時，將小鼠肉瘤細胞在體外與3D生物支架混合，3D生物支架的孔徑能夠使得小鼠肉瘤細胞維持其三維生長狀態，然后對小鼠肉瘤細胞進行培養和擴增，制備Matrigel原液。該制備工藝時間短，所用小鼠量少，可大大降低批次間的差異性。

技術領域

本發明涉及Matrigel的制備技術領域，具體涉及一種肉瘤細胞培養基以及采用該培養基體外生產Matrigel原液的方法。

背景技術

Matrigel是一種從富含細胞外基質的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜基質，其主要成分有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包含生長因子和基質金屬蛋白酶等幾乎所有的細胞外基質成分。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學活性的三維基質，模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養和分化，廣泛應用于干細胞分化、培養、類器官培養等研究中。然而現有的Matrigel制作技術，嚴重依賴于小鼠動物模型，需要將EHS小鼠肉瘤接種到C57BL6N小鼠皮下，等待大概2-3個月時間，再將接種的肉瘤取出，進行分離、純化出Matrigel原液。整個過程耗時較長，費用較高，而且需要用到大量的小鼠，導致不同批次的Matrigel存在生物活性差異較大的問題。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述不足，本發明的目的是提供一種肉瘤細胞培養基以及采用該培養基體外生產Matrigel原液的方法，以解決現有技術存在的制備時間長，不同批次之間差異大的問題。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：提供一種肉瘤細胞培養基，包括：DMEM/F12基礎培養基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸鈉0.5-1.5mM、氫化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制劑I3MT-3 8-12μM。

采用上述技術方案的有益效果為：該培養基以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后加入FBS，FBS中含有血漿蛋白、多肽，生長因子，激素等，可促進肉瘤細胞生長和存活，并且可提供基礎培養基中沒有或量很少的營養物；ITS中除了含有胰島素和轉鐵蛋白以外，還含有硒，可為基礎培養基補充其他微量元素，在肉瘤細胞的增殖中發揮著重要；丙酮酸鈉可作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是在培養基中加入丙酮酸鈉后，當培養基中沒有葡萄糖時，細胞也可以代謝丙酮酸鈉，為其生長提供能量；培養基中再加入氫化可的松、生長因子FGF2、EGF，其協同基礎培養基、FBS、ITS、丙酮酸鈉共同提升肉瘤細胞的增殖效率和活性，此外，Hippo抑制劑I3MT-3可用于擴大肉瘤細胞的體積，使得肉瘤細胞快速擴增變大，縮短收獲細胞的時間，進而用于制備Matrigel原液。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進：

進一步，一種肉瘤細胞培養基，包括：DMEM/F12基礎培養基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸鈉1mM、氫化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制劑I3MT-3 10μM。

采用上述技術方案的有益效果為：各組分之間相互協同作用，搭配最佳濃度，可更有效加快細胞培養和增殖速率。

采用上述培養基體外生產Matrigel原液的方法，包括以下步驟：

將小鼠肉瘤細胞在體外與3D生物支架混合，然后在上述肉瘤細胞培養基中進行懸浮培養，最后收獲細胞制備Matrigel原液，具體為：

(1)對小鼠肉瘤細胞進行分離純化；