[發(fā)明專利]一種肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基以及采用該培養(yǎng)基體外生產(chǎn)Matrigel原液的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110525501.1
• 申請(qǐng)日: 2021-05-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113106066B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 游明亮;申重陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州艾名醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N5/02;C12N11/10;C12N11/04
• 代理公司: 北京正華智誠(chéng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11870
• 代理人: 代維凡

1.一種肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸鈉0.5-1.5mM、氫化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制劑I3MT-3 8-12μM。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸鈉1mM、氫化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制劑I3MT-3 10μM。

3.采用權(quán)利要求1或2所述的肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基體外生產(chǎn)Matrigel原液的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將小鼠肉瘤細(xì)胞在體外與3D生物支架混合，然后在上述肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，最后收獲細(xì)胞制備Matrigel原液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，具體過(guò)程如下：

(1)對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞進(jìn)行分離純化；

(2)將分離純化后的小鼠肉瘤細(xì)胞與3D生物支架混合，得混合液，將混合液滴入CaCl₂溶液中，形成肉瘤細(xì)胞凝膠微球，再將肉瘤細(xì)胞凝膠微球加入上述肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，最后收獲細(xì)胞；

(3)將收獲的細(xì)胞進(jìn)行離心、裂解、除上清，最后重懸，制得Matrigel原液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體過(guò)程為：將小鼠肉瘤細(xì)胞用胰酶消化，然后對(duì)其吹打，終止消化，將消化后的細(xì)胞離心，收集沉淀，并對(duì)沉淀進(jìn)行重懸，再離心，收集沉淀，得分離純化后的小鼠肉瘤細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的3D生物支架為海藻酸鈉。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體過(guò)程為：將分離純化后的小鼠肉瘤細(xì)胞與0.5-1.5wt％的海藻酸鈉混合，得混合液，將混合液滴入0.05-0.15mol/L的CaCl₂溶液中，形成肉瘤細(xì)胞凝膠微球，再將肉瘤細(xì)胞凝膠微球加入肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-40℃，CO₂濃度為5％，培養(yǎng)12-16天，收獲細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中海藻酸鈉的濃度為1wt％。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中CaCl₂溶液的濃度為0.1mol/L。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體過(guò)程為：將收獲的細(xì)胞于150-250g的速度離心8-15min，然后加入3-4.5mol/L NaCl裂解緩沖液，混勻后，以6000-8000g的速度離心10-20min，去除上清，并重復(fù)1-2次，再采用TBS緩沖液重懸，制得Matrigel原液。