[發明專利]用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒及提取方法

在審

• 申請號: 202110523665.0
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113088516A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 張幫周;何劍全;羅旌萬;肖傳興;林愛強;楊璐溪
• 申請（專利權）人: 張幫周
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南昌金軒知識產權代理有限公司 36129
• 代理人: 殷康明

1.一種用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，包括除雜液A、裂解液B、漂洗液C、漂洗液D以及洗脫液E，所述除雜液A、所述裂解液B、所述漂洗液C、所述漂洗液D以及所述洗脫液E依次加入試管中與糞便微生物相反應，以提取DNA，其特征在于：

所述除雜液A包括以下物質：CTAB、EDTA、PVP30、NaCl、TritonX-100、Tween-20、檸檬酸以及檸檬酸鈉；

所述裂解液B包括以下物質：鹽酸胍、CTAB、PVP30、檸檬酸以及檸檬酸鈉。

2.根據權利要求1所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

在所述除雜液A中，CTAB的質量比范圍配置為1～3％m/m，EDTA的體積摩爾濃度范圍配置為20～30mM，PVP30的質量比范圍配置為1～3％m/m，NaCl的體積摩爾濃度范圍配置為1.5～2.0M，TritonX-100的體積比范圍配置為1～3％v/v，Tween-20的體積比范圍配置為0.5～1％v/v，檸檬酸的體積摩爾濃度范圍配置為0.1～0.5M，檸檬酸鈉的體積摩爾濃度范圍配置為0.2～1M，所述除雜液A的pH范圍配置為4.0～4.5。

3.根據權利要求1所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

在所述裂解液B中，鹽酸胍的體積摩爾濃度范圍配置為4～6M，CTAB的質量比范圍配置為0.5～1.5％m/m，PVP30的質量比范圍配置為0.5～1.5％m/m，檸檬酸的體積摩爾濃度范圍配置為0.1～0.5M，檸檬酸鈉的體積摩爾濃度范圍配置為0.2～1M，所述裂解液B的pH范圍配置為4.0～4.5。

4.根據權利要求1所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

所述漂洗液C包括以下物質：鹽酸胍、NaCl以及無水乙醇。

5.根據權利要求1所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

所述漂洗液D包括以下物質：Tris以及無水乙醇。

6.根據權利要求1所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

所述洗脫液E包括以下物質：Tris以及EDTA。

7.根據權利要求4所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

在所述漂洗液C中，鹽酸胍的體積摩爾濃度范圍配置為2～4M，NaCl的體積摩爾濃度配置為0.15M，無水乙醇的體積比配置為56％v/v。

8.根據權利要求5所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

在所述漂洗液D中，Tris的體積摩爾濃度配置為25mM，無水乙醇的體積比配置為70％v/v，所述漂洗液D的pH范圍配置為7～7.5。

9.根據權利要求6所述的用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒，其特征在于：

在所述洗脫液E中，Tris的體積摩爾濃度配置為10mM，EDTA的體積摩爾濃度配置為0.5mM，所述洗脫液E的pH配置為8.0。

10.一種用于權利要求1至9任一項所述用于糞便微生物基因組的DNA提取試劑盒的提取方法，按除雜步驟、裂解步驟、漂洗步驟以及洗脫步驟依次執行，其特征在于：

所述除雜步驟具體包括以下步驟：

1)稱取新鮮糞便置于滅菌離心管中；

2)添加所述除雜液A到上述離心管中，在渦旋振蕩器中勻質化5min；

3)將勻質化后的樣品置于70℃的金屬浴中孵育5min，期間每隔2min分鐘上下顛倒混勻1次：

4)孵育結束后，將樣品放于離心機中14000rpm離心1min；

其中，每200mg的糞便加入1ml的所述除雜液A；

所述裂解步驟具體包括以下步驟：

5)取所述第4)步驟的上清液于一新的滅菌離心管中；

6)加入所述裂解液B和蛋白酶K；

7)上下顛倒混勻多次后，放于70℃的金屬浴中孵育10min，期間每隔3min分鐘上下顛倒混勻1次：

8)孵育結束，加入無水乙醇；

9)輕輕上下顛倒混勻，吸取滅菌離心管溶液過核酸純化吸附柱，放于離心機中12000rpm離心30s；

10)丟棄廢液；

11)重復所述第9)步驟～所述第10)步驟直至裂解液全部過柱；

所述漂洗步驟具體包括以下步驟：

12)向吸附柱中加入所述漂洗液C，放于離心機中12000rpm離心30s；

13)丟棄廢液；

14)向吸附柱中加入所述漂洗液D，放于離心機中12000rpm離心30s；

15)丟棄廢液；

16)將吸附柱重新放于離心機中，放于離心機中12000rpm空離3min；

所述洗脫步驟具體包括以下步驟：

17)轉移吸附柱到無菌離心管中，加入所述洗脫液E；

18)室溫孵育1min后，放于離心機中12000rpm離心2min回收洗脫液；

其中，所述除雜液A、所述第4)步驟的上清液、所述裂解液B、所述蛋白酶K、所述第8)步驟的無水乙醇、所述漂洗液C、所述漂洗液D以及所述洗脫液E之間依次按照1000：600：600：25：600：600：600：60的比例進行配比添加。