[發(fā)明專利]一種生姜青枯病雷爾氏菌的PCR檢測方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110521614.4
• 申請(qǐng)日: 2021-05-13
• 公開（公告）號(hào): CN113151523A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉奕清;張玲玲;周潔;劉燃;張?zhí)鞎?/a>;周弦;賈切
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長江大學(xué);湖北美田生物科技有限公司;重慶市幅沅農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究院有限公司;荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 張國棟

本發(fā)明公開了一種生姜青枯病雷爾氏菌的PCR檢測方法。由于生姜青枯病逐年加重，為防止帶菌姜種和帶菌土壤引起的生姜青枯病的發(fā)生和傳播，亟需建立快速準(zhǔn)確、快速檢測病原菌的方法，PCR檢測病原菌成本低，操作簡便，適合檢測診斷應(yīng)用，本方法通過引物篩選和條件優(yōu)化，建立了生姜青枯病雷爾氏菌的PCR檢測技術(shù)，可用于發(fā)病植株和土壤中青枯病菌的檢測，預(yù)防重大土傳病害的發(fā)生，滿足當(dāng)前生產(chǎn)需要。該方法具有靈敏度高、速度快，能準(zhǔn)確地檢測田間病株及根際土壤中的青枯雷爾氏菌，為生姜青枯病的早期預(yù)防提供了有效的技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生姜青枯病雷爾氏菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種生姜青枯病雷爾氏菌的PCR檢測方法。

背景技術(shù)

為了明確引起湖北生姜青枯病的病原菌及建立快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，本方法對(duì)自湖北恩施采集的生姜病樣進(jìn)行分離，基于形態(tài)學(xué)特征，分子生物學(xué)和致病性測定的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，從已報(bào)道的青枯雷爾氏菌的特異性引物進(jìn)行篩選驗(yàn)證，獲得條帶的特異性引物，創(chuàng)建并優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立生姜青枯病PCR檢測技術(shù)，為生姜青枯病害的早期預(yù)防、診斷及防控提供技術(shù)支持。

為有效防控生姜青枯病，本發(fā)明對(duì)湖北恩施的生姜青枯病病樣進(jìn)行分離，基于形態(tài)學(xué)特征、分子生物學(xué)和致病力測定對(duì)其進(jìn)行鑒定，并采用PCR技術(shù)對(duì)已報(bào)道的21F-21R特異性引物進(jìn)行特異性和靈敏度檢驗(yàn)，創(chuàng)建并優(yōu)化PCR檢測方法。該發(fā)明對(duì)生姜青枯病雷爾氏菌的分離鑒定及PCR檢測方法的建立，為指導(dǎo)生姜青枯病的早期預(yù)測和防治提供重要的參考依據(jù)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

(一)解決的技術(shù)問題

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種生姜青枯病雷爾氏菌的分離鑒定與PCR檢測方法，具備降低了檢測過程中的成本，提高了檢測效率，靈敏度也符合實(shí)際生產(chǎn)過程中的檢測需求的優(yōu)點(diǎn)，解決了目前，國際上利用PCR檢測技術(shù)對(duì)蔬菜土傳病原菌進(jìn)行帶菌檢測的方法較多，但對(duì)生姜枯萎病進(jìn)行病菌檢測尚未見報(bào)道的問題。

(二)技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述目的，該發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種生姜青枯病雷爾氏菌的分離鑒定與PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)生姜青枯病病害調(diào)查、樣品采集與病原菌的分離：

生姜青枯病雷爾氏菌的分離在前人的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，將采集的病株用無菌刀截取根莖部，在超凈工作臺(tái)中，剝?nèi)ネ獗砥?，切下病變組織，置于裝有50mL無菌水的三角瓶中，37℃、150rpm振蕩，待無菌水有少許渾濁感后，用接種環(huán)沾取少量液體，采用平板劃線分離法接種到TTC培養(yǎng)基平板上，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，長出的菌落用于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

從湖北恩施采集的樣品中分離得到10株菌落形態(tài)和顏色與標(biāo)準(zhǔn)青枯雷爾氏菌相近的菌株，分別命名為ES202023～ES202033，選取ES202023菌株為代表作為形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定的候選菌株。

2)形態(tài)學(xué)鑒定：

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，將平板上菌落顏色和形狀與青枯雷爾氏菌相似的單菌落重新接到TTC平板上，觀察菌落的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征等，并進(jìn)行革蘭氏染色，電子顯微和掃描電鏡觀察其具體形狀。

ES202023在TTC培養(yǎng)基上表面濕潤有光澤，流動(dòng)性極強(qiáng)，生長到第三天菌落中間出現(xiàn)粉紅色，革蘭氏染色的結(jié)果顯示菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)菌株青枯雷爾氏菌一致。

3)分子生物學(xué)鑒定：