[發明專利]一種生姜青枯病雷爾氏菌的PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110521614.4
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113151523A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 劉奕清;張玲玲;周潔;劉燃;張天曉;周弦;賈切
• 申請（專利權）人: 長江大學;湖北美田生物科技有限公司;重慶市幅沅農業生物技術研究院有限公司;荊州農業科學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 張國棟

1.一種生姜青枯病雷爾氏菌PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)生姜青枯病病害調查、樣品采集與病原菌的分離：

生姜青枯病雷爾氏菌的分離在前人的基礎上加以改進；從湖北恩施采集的樣品中分離得到10株菌落形態和顏色與標準青枯雷爾氏菌相近的菌株，分別命名為ES202023～ES202033，選取ES202023菌株為代表作為形態學和分子生物學鑒定的候選菌株；

2)形態學鑒定：

ES202023在TTC培養基上表面濕潤有光澤，流動性極強，生長到第三天菌落中間出現粉紅色，革蘭氏染色的結果顯示菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，形態與標準菌株青枯雷爾氏菌一致；

3)分子生物學鑒定：

以提取的基因組為模板，以16SrDNA通用引物16S-F和16S-R PCR擴增16SrDNA序列，得到1400bp的特異片段，將測序得到的16SrDNA序列在NCBI數據庫進行BLAST搜索后獲取相關種屬的16SrDNA序列，對比發現：與已經報道的青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum 16S(登錄號：MN830162.1)序列相似性為99.9％，下載相似度較高的多條序列、同屬序列和外群序列，與ES202023序列一起，用MEGA7.0軟件按鄰接法構建系統進化樹；

ES202023與多條青枯雷爾氏菌聚在同一分支上，結合形態學特征與分子生物學鑒定，將菌株ES202023鑒定為青枯雷爾氏菌；

4)致病力測定：

將活化后的菌株ES202023接種健康的生姜苗上，以接種無菌水為對照，觀察菌株對生姜的致病性，結果顯示，接種ES202023的生姜植株在第3天后生姜葉片逐步變成深褐色，然后蔓延到周邊地區，最后慢慢枯萎，兩周后植株全部死亡，這與采集的生姜青枯病的植株表現出來的癥狀完全一致。

5)生姜青枯病雷爾氏菌PCR檢測方法的建立：

S1、檢索國內外關于生姜青枯病雷爾氏菌的分子檢測報道，選取特異性引物21R-21F，用引物21F和21R對所有供試菌株基因組DNA進行擴增，電泳檢測，僅青枯菌基因組DNA能擴增除一條125bp的特異性條帶，其他對照菌株與陰性對照均無擴增現象，并且對擴增產物經克隆測序后，通過GenBank上BLAST比對，同源性均達到99％，因此確定擴增產物為目標菌株，引物21F，21R具有特異性，能夠有效區別青枯病菌與其他病原菌；

S2、通過對退火溫度、延伸時間和循環次數的優化，最終確定PCR反應方法(總體積為25μL)：2×Taq Master PCR Mix12.5μL，引物21F/21R0.5μL，模板1μL，補加ddH2O至25μL，反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸10min；

6)PCR反應靈敏度檢測：

利用優化后的PCR反應條件對8個不同濃度梯度的模板DNA進行擴增，隨模板DNA濃度的降低條帶亮度也在下降，引物21對供試菌株基因組的最低檢測濃度為10^-2ng.μL^-1；

7)發病植株組織和土壤中青枯病菌的檢測：

3份人工接種的病株組織都擴增出條帶，7份不同地區采集的病株組織只有湖北恩施和四川綿陽的病株組織擴增出條帶，其余地區病株與健康植物均未擴增條帶，檢測結果與分離培養結果吻合，說明此方法可以檢測有菌植株和帶菌土壤青枯菌。

2.根據權利要求1所述的一種生姜青枯病雷爾氏菌的分離鑒定與PCR檢測方法，其特征在于，所述生姜青枯病雷爾氏菌的分離在前人的基礎上加以改進，改進過程包括：將采集的病株用無菌刀截取根莖部，在超凈工作臺中，剝去外表皮，切下病變組織，置于裝有50mL無菌水的三角瓶中，37℃、150rpm振蕩，待無菌水有少許渾濁感后，用接種環沾取少量液體，采用平板劃線分離法接種到TTC培養基平板上，放置于30℃恒溫培養箱中培養48h，長出的菌落用于形態學和分子生物學鑒定。