[發明專利]一種載體系統、制備豬成纖維細胞和基因編輯豬的方法

在審

• 申請號: 202110521234.0
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113403337A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 吳珍芳;張健;田廣;蔡更元
• 申請（專利權）人: 溫氏食品集團股份有限公司;華南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 林棟

本發明涉及基因編輯領域，具體涉及一種載體系統、制備豬成纖維細胞和基因編輯豬的方法。所述載體系統包括CD163基因敲除載體和MSTN基因敲除載體，所述CD163基因敲除載體包括載體骨架以及連接到該載體骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：1；所述MSTN基因敲除載體包括載體骨架以及連接到該載體骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：2。本發明載體系統和方法具有降低基因操作難度、提高敲除效率，在短時間內快速將CD163基因和MSTN基因敲除的優點。本發明方案無需藥物篩選，不帶有外源篩選標記，具有較為簡便的細胞篩選流程。可以一次性獲得雙基因缺失的細胞系，大大縮短了雙/多基因編輯動物的制備流程。

技術領域

本發明涉及基因編輯領域，具體涉及一種載體系統、制備豬成纖維細胞和 基因編輯豬的方法。

背景技術

豬生殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由豬生殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的以豬厭食、發熱，妊娠母豬早產、晚期流產、死胎、弱胎 和木乃伊胎等繁殖障礙及仔豬和生長豬的呼吸系統疾病和高度死亡性為主要特 征的一種高度接觸性傳染病。因該病在臨床上表現為耳部皮膚紫紺，所以又被 稱為“藍耳病”。

PRRSV在體內主要感染分化良好的豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolarmacrophages，PAM)。PRRSV侵染靶細胞的先決條件是與宿主細胞吸附，而宿 主細胞表面的受體是完成這種吸附過程必不可少的。研究發現，硫酸乙酰肝素 (Heparin Sulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)和CD163(Cluster of Differentiation 163)分子是PAM上存在的能與PRRSV結合的三個重要受體分子。 其中，CD163是一種富含半胱氨酸的清道夫受體，是典型的Ⅰ型糖基化蛋白， 也是一種巨噬細胞分化的抗原，分子大小是130kD，固又被稱為M130蛋白。 CD163起初是作為巨噬細胞和單核細胞的特異性鑒別蛋白質被認識的，在肺、 脾臟、肝臟、淋巴集結和胸腺組織的巨噬細胞中都有表達。有研究表明，在PRRSV 非易感細胞系(如BHK-21和PK-15)中轉染表達CD163分子可以使這些細胞系感 染PRRSV并在細胞內產生子代病毒粒子，抗人CD163的抗體可以阻斷PRRSV 的感染，表明CD163是該病毒的必需受體。CD163蛋白結構域SRCR5是病毒 感染細胞所必需的，而氨基端的4個SRCR和胞質尾部是非必需的，其中SRCR5 結構域正是由CD163第7外顯子所編碼。因此，研究CD163基因修飾豬可以為 CD163受體是否是PRRSV感染過程中的重要角色提供必要證據。

本發明的另一方面涉及到豬的肌肉產量。肌肉的生長受到多種因素的調控， 其中肌生成抑制素起著主要的負調控作用。肌生成抑制素(Myostatin，MSTN) 或生長分化因子-8(GDF-8)，屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族，是肌肉 的主要負調控因子。敲除肌生成抑制素基因的小鼠肌纖維發生廣泛性的增生和 肥大，骨骼肌量顯著增加，平均體重超過正常小鼠的261％，但不存在其他表型 差異。而且肌生成抑制素基因敲除小鼠肌量增加的表型可終生維持，年老的肌 生成抑制素基因敲除鼠比對照鼠肌肉量與肌力都增加。

在養豬業中，產肉率提升和抗病性能提升都是產業的重要需求，這些性狀 也是傳統選擇性育種的難點之一。本發明采用基因工程改造技術對種豬相關性 狀的對應基因位點進行定向修飾，建立一種快速簡易的多基因同時編輯方案， 一次性地賦予動物多方面的表型，為建立優勢種豬育種材料提供便捷方案，對 養殖業具有積極推動作用。

基于此，本發明建立一種可以快速、準確、有效地同時敲除豬CD163基因 和MSTN基因的方法，獲取敲除豬CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞 或豬在研究提升豬藍耳病抗性、提高豬的瘦肉率以及豬的新品種培育具有重要 的意義。

發明內容