[發明專利]一種載體系統、制備豬成纖維細胞和基因編輯豬的方法

在審

• 申請號: 202110521234.0
• 申請日: 2021-05-13
• 公開（公告）號: CN113403337A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 吳珍芳;張健;田廣;蔡更元
• 申請（專利權）人: 溫氏食品集團股份有限公司;華南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 林棟

1.一種用于同時敲除CD163基因和MSTN基因的載體系統，其特征在于，所述載體系統包括CD163基因敲除載體和MSTN基因敲除載體，其中：

所述CD163基因敲除載體包括載體骨架以及連接到該載體骨架上的第一DNA片段，所述第一DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述MSTN基因敲除載體包括載體骨架以及連接到該載體骨架上的第二DNA片段，所述第二DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述CD163基因敲除載體與所述MSTN基因敲除載體中的載體骨架均為CRISPR/Cas9。

2.根據權利要求1所述用于同時敲除CD163基因和MSTN基因的載體系統，其特征在于，所述CRISPR/Cas9為pX330。

3.一種制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)構建權利要求1～2任一項所述用于同時敲除CD163基因和MSTN基因的載體系統；

(2)將載體系統轉入豬成纖維細胞中，通過篩選和鑒定獲得純合敲除CD163基因和MSTN基因的單克隆細胞。

4.根據權利要求3所述制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述豬成纖維細胞為豬胎兒成纖維細胞。

5.根據權利要求3所述制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為：

將互補的寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，與經過酶切的載體骨架連接，篩選獲得陽性克隆即得CD163基因敲除載體，所述互補的寡核苷酸單鏈的序列如SEQ ID NO：3-4所示；

將互補的寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，與經過酶切的載體骨架連接，篩選獲得陽性克隆即得MSTN基因敲除載體，所述互補的寡核苷酸單鏈的序列如SEQ ID NO：5-6所示；

得到包括CD163基因敲除載體和MSTN基因敲除載體的載體系統。

6.根據權利要求3所述制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為：將步驟(1)所得CD163基因敲除載體和MSTN基因敲除載體通過電轉染的方式轉入豬成纖維細胞，通過有限稀釋法篩選得單克隆細胞，并鑒定所述單克隆細胞是否為CD163基因和MSTN基因純合敲除的陽性單克隆細胞，得到純合敲除CD163基因和MSTN基因的單克隆細胞。

7.根據權利要求6所述制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的鑒定具體為：提取純合敲除CD163基因和MSTN基因的單克隆細胞的基因組DNA，分別使用如SEQ ID NO：7-8和SEQ ID NO：9-10所示引物進行PCR擴增，并對擴增產物進行測序，根據測序結果判定所述單克隆細胞是否為CD163基因和MSTN基因純合敲除的陽性單克隆細胞。

8.根據權利要求7所述制備同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)的鑒定中，使用SEQ ID NO：7-8為引物的PCR擴增的退火溫度為57～59℃，循環數為32～38；使用SEQ ID NO：9-10為引物的PCR擴增的退火溫度為60～62℃，循環數為32～36。

9.根據權利要求3-8任一項方法制備而成的同時敲除CD163基因和MSTN基因的豬成纖維細胞。

10.一種基因編輯豬的方法，其特征在于，包括如下步驟：

將權利要求9所述豬成纖維細胞作為核移植供體細胞，將其細胞核移植入去核的卵母細胞，制備重組克隆胚胎并移植入母體內經妊娠獲得同時敲除CD163基因和MSTN基因的基因編輯豬。