[發明專利]經過反密碼子編輯的tRNA作為分子開關在精準控制蛋白表達及病毒復制中的應用

在審

• 申請號: 202110516652.0
• 申請日: 2021-05-12
• 公開（公告）號: CN113308463A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 湯艷東;蔡雪輝
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85;C12P21/00;C12N7/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發明公開了經過反密碼子編輯的tRNA作為分子開關在精準控制蛋白表達及病毒復制中的應用。所述的經過反密碼子編輯的tRNA攜帶正常氨基酸，同時能夠識別所述的提前終止密碼子，并將攜帶的氨基酸插入到相應的位置，從而使得蛋白以及復制缺陷型病毒能夠在該tRNA存在下完成表達及復制。該方法并不依賴特殊的氨酰tRNA合成酶以及UAA。僅對tRNA的反密碼子編碼序列進行突變改造就可以實現攜帶正常氨基酸的tRNA識別終止密碼子并將攜帶的氨基酸插入到相應的位置，從而實現對蛋白表達以及復制缺陷型病毒精準調控，提高疫苗的安全性。本發明提供了一種用于蛋白或病毒精準控制的新方法，特別是在新型的復制缺陷型病毒疫苗的生產中將具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及經過反密碼子編輯的tRNA的新用途，特別涉及經過反密碼子編輯的tRNA作為分子開關在精準控制蛋白表達及復制缺陷型病毒復制中的應用，本發明屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

病原微生物引起機體的疾病對人類以及動物健康造成了巨大的影響，制造安全有效的疫苗是控制病原微生物感染的優先選擇。然而，疫苗的安全性以及有效性很難兼得。如果給病原微生物安裝精確調控其復制的“分子開關”，使其在體外復制可控，在體內不能復制，但是可以同時激活細胞免疫反應與體液免疫反應，從而使疫苗更安全。這種形式的疫苗代表了一種奇妙的疫苗的中間形式，即在滅活疫苗(安全但免疫原性低)和弱毒疫苗(免疫原性好但不安全)之間的新型疫苗。

精準調控病毒復制的分子開關使上述設想成為可能，在本發明之前，密碼子拓展技術的出現使滿足上述要求的疫苗成為可能，該技術結合病毒的基因組已經用于復制缺陷型病毒疫苗的研究。在該種病毒生產過程中，琥珀密碼子(UAG) 被整合到病毒基因組的必須基因中，這樣病毒可以在含有正交系統aaRS/tRNA對及非天然氨基酸(UAA)存在的情況下復制[1-3]。由于宿主不包含特殊的aaRS/tRNA對，病毒只能經歷一個周期的感染，不能復制。這一技術最近已應用于HIV-1[1,3]流感病毒A[2]以及寨卡病毒[4]疫苗的研究。流感病毒的動物實驗證明，該疫苗效果理想，兼具治療和預防功能并且能激發強大的體液免疫和細胞免疫。

然而，密碼子拓展技術的實施需要特殊的氨酰tRNA合成酶，只催化非天然氨基酸與與其配對的tRNA結合，而不參與細胞內源的tRNA與氨基酸結合。同時需要特殊的人工合成的非天然氨基酸，病毒的組裝過程復雜，對UAA的大小與結構有嚴格要求，必須與該位置原有的氨基酸相似，這使得在活的病毒蛋白中包含進UAA富有挑戰。目前應用較多的正交系統包括大腸桿菌中獲得的tRNA^Tyr-tyrosyl-tRNA合成酶對(TyrRS)[5]以及古菌中tRNA^Pyl-pyrrolysyl-tRNA合成酶對(PylRS)等[6-8]，它們只在UAG琥珀密碼子中插入UAA。

綜上所述，密碼子拓展技術應用在正交對的選擇，突變位點的選擇以及底物的選擇上仍存在各種各樣的挑戰[1]。

參考文獻：

[1]WANG N,LI Y,NIU W,et al.Construction of a live-attenuated HIV-1vaccine through genetic code expansion[J].Angew Chem Int Ed Engl.2014,53(19):4867-4871.

[2]SI L,XU H,ZHOU X,et al.Generation of influenza A viruses as livebut replication-incompetent virus vaccines[J].Science.2016,354(6316):1170-1173.