[發(fā)明專利]一種交聯(lián)瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110509429.3
• 申請(qǐng)日: 2021-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113231049B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)漢杰;莊偉;周曉紅;周文鳳;朱晨杰;吳菁嵐;李明;楊朋朋;陳勇;柳東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): B01J20/285
• 分類號(hào): B01J20/285;B01J20/30;B01D15/08;C12N9/00;C12P19/30
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

本發(fā)明公開(kāi)了一種交聯(lián)瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法與應(yīng)用，所述制備方法包括如下步驟：(1)將含瓊脂糖的分散相與含乳化劑的連續(xù)相于微通道反應(yīng)裝置中反應(yīng)，所得反應(yīng)液于收集液中固化，得到瓊脂糖微球；(2)將步驟(1)所得瓊脂糖微球依次經(jīng)如下步驟處理后得到交聯(lián)瓊脂糖親和介質(zhì)；(i)溶脹、活化、多羥基聚合物修飾；(ii)交聯(lián)；(iii)活化、偶聯(lián)亞氨基二乙酸配基；(iv)螯合鎳離子。經(jīng)修飾后的微球，用于酶的純化和固定，解決了酶在復(fù)雜的分離純化的過(guò)程中易失活和無(wú)法回收再利用等問(wèn)題，同時(shí)合成的親和介質(zhì)用于酶的純化，降低了酶液中雜酶對(duì)產(chǎn)物的影響，此方法制備胞苷酸，具有反應(yīng)條件溫和，綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶的催化及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種交聯(lián)瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法與在純化酶和酶催化產(chǎn)胞苷酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

酶是一種由細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化能力的生物催化劑，其本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，它具有較高的催化效率，高度的專一特性，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)都是在酶的催化作用下完成的。

酶的催化合成可以是一種或多種酶催化反應(yīng)，反應(yīng)既可以為平行進(jìn)行的，也可以是并聯(lián)合成更加復(fù)雜的化合物。在多酶體系中，酶進(jìn)行有效催化需要輔酶因子的參與，如NADH、ATP等。ATP作為反應(yīng)中的磷酸供體，價(jià)格昂貴。但用乙酸激酶催化乙酰磷酸和ADP生成ATP，可形成ATP的能量再生循環(huán)，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，乙酰磷酸價(jià)格便宜，利用乙酸激酶催化的ATP的再生，達(dá)到了節(jié)約成本的目的。

為了滿足對(duì)一些大分子量的底物進(jìn)行有效的催化，需要將酶工程重組的酶破碎獲得粗提液，進(jìn)行分離純化得到的酶可用于底物的高效催化。目前蛋白質(zhì)的分離純化有沉淀法如鹽析、生物堿或酸沉淀法；層析法如親和層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析；離心法等。對(duì)于不同的目標(biāo)酶而言，不同的純化方法有其特定的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。固定化金屬離子親和層析(IMAC)是一種高效的親和層析方法。因其螯合介質(zhì)制備簡(jiǎn)單，吸附容量大，容易再生等優(yōu)點(diǎn)得到越來(lái)越多的應(yīng)用。用于IMAC的親和配基有亞氨基二乙酸(IDA)、三羧甲基乙二胺(TED)和次氮基三乙酸(NTA)。基本原理就是蛋白表面的組氨酸殘基的咪唑環(huán)或半胱氨酸殘基與過(guò)渡金屬離子(Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺)，螯合形成配體，達(dá)到分離純化目標(biāo)蛋白的目的。同時(shí)，IMAC柱可以再生重復(fù)使用。正因如此，固定化金屬螯合層析法在蛋白質(zhì)與核酸的分離純化、蛋白質(zhì)的定向固定中得到廣泛應(yīng)用。

然而，游離酶對(duì)外界環(huán)境非常敏感，易受熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等極端條件的影響而失去活性，從而限制了其在工業(yè)應(yīng)用的發(fā)展。

近年來(lái)，酶的固定化是酶的一項(xiàng)重要的應(yīng)用技術(shù)，解決了上述酶存在的問(wèn)題，酶的固定化是指以有機(jī)或無(wú)機(jī)固體材料作為載體，采用物理或化學(xué)方法將酶束縛、限制于其表面和微孔中。與游離酶相比，“定制”得到具有特殊用途的固定化酶的穩(wěn)定性得到改進(jìn)、能在苛刻的環(huán)境中表現(xiàn)優(yōu)良的活性，增強(qiáng)了酶的使用壽命，節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本。酶的固定化方法有物理法和化學(xué)法兩大類，物理法包括吸附和包埋法，化學(xué)法包括交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合法。酶的固定化方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)和合成優(yōu)異性能的酶固定化材料是解決酶的固定化問(wèn)題的方法之一。

酶的固定化載體有無(wú)機(jī)載體(如石墨、羥基磷石灰等)，有機(jī)載體(如一些天然高分子材料等)，生物大分子載體(如海藻酸鈉、殼聚糖等)。載體的物理化學(xué)性質(zhì)極大的影響著蛋白質(zhì)的吸附過(guò)程，選擇適合的酶固定化載體要考慮到載體的機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)及熱穩(wěn)定性、生物相容性、比表面積和酶的類型等。近年來(lái)，瓊脂糖因其良好的生物相容性與可降解性，在生物分離純化領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。瓊脂糖作為常用的載體材料，主要有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)具有多孔性：瓊脂糖微球的大孔可容許大分子量物質(zhì)的擴(kuò)散；(2)具有親水性：瓊脂糖分子表面含有大量羥基，便于在親水的環(huán)境中進(jìn)行；(3)具有衍生性：瓊脂糖表面由密度適宜的活性基團(tuán)羥基容易與一些功能基團(tuán)鍵合，衍生出陰、陽(yáng)離子交換介質(zhì)、親和層析介質(zhì)等，在整個(gè)生物產(chǎn)品的分離過(guò)程中起到了十分重要的作用。目前，瓊脂糖微球的制備方法有傳統(tǒng)的攪拌乳化法、噴霧干燥法、膜乳化法等。但通過(guò)上述方法容易導(dǎo)致合成的交聯(lián)瓊脂糖粒徑不均一，設(shè)備要求高等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容