[發明專利]AvrPiz-t中持有Inago2的solo-LTR毒性候選菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 202110509167.0
• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN113278722A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 李進斌;王群;陸琳;何成興
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院農業環境資源研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 昆明科眾知識產權代理事務所(普通合伙) 53218
• 代理人: 方金敏

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及利用特異性引物對稻瘟病菌無毒基因AvrPiz?t中插入Inago2反轉座子的solo?LTR片段的毒性菌株進行快速鑒定的引物和方法。本發明首次開發了一對特異的引物，該引物可以快速檢測稻瘟病菌AvrPiz?t基因啟動子區是否插入了反轉座子Inago2的solo?LTR片段，從而為毒性候選菌株的快速篩選提供保障，為田間菌株的動態變化檢測提供了技術支撐，為稻瘟病抗性育種及稻瘟病綜合防控提供指導信息，也為開展稻瘟病致病機理研究提供素材。該引物特異性強，靈敏度高，可快速篩選出稻瘟病菌對IRBLzt?T致病的毒性候選菌株，具有重要的科研和應用價值。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及利用特異性引物對稻瘟病菌無毒基因AvrPiz-t是否插入Inago2反轉座子的solo-LTR片段進行毒性菌株快速鑒定的方法。

背景技術

稻瘟病是水稻生產上最具毀滅性的一種真菌病害?？剐曰?Resistance gene,R)的利用是控制稻瘟病最經濟、生態友好的一種措施。然而由于稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的高度、快速變異使水稻抗性品種在種植3-5年后就“喪失”抗性。水稻抗性基因(Resistance gene,R)和稻瘟病菌無毒基因(Avirulance gene,Avr)互作符合Flor的基因對基因學說，即當兩個基因同時存在才能相互作用引發水稻的抗性反應，反之缺少兩者之中任何一個基因都不能引發水稻的免疫反應，水稻都感病。

稻瘟病菌Piz-t基因是一個稻瘟病廣譜抗性基因，是生產和育種上有較高利用價值的一個抗性基因，已于2006年克隆成功。相應的無毒基因AvrPiz-t也于2009年克隆成功。利用PCR擴增反應及測序技術檢測稻瘟病菌菌株是否持有AvrPiz-t基因以及是否發生變異成為可能。稻瘟病菌無毒基因決定水稻中相應抗性基因的有效性。無毒基因的存在與否及變異都會影響抗性基因“喪失”。堿基在無毒基因的編碼區、上游及下游的插入是無毒基因變異的一種方式。插入的堿基可以是轉座子、反轉座子、重復性DNA元件，也可以是單個堿基的插入。轉座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。它對基因的結構及功能具有很大的可塑性。目前已有相關報道表明轉座子對稻瘟病菌無毒基因的功能轉變發生作用。如：AVR-Pia側翼轉座子Pot3序列的插入及AVR-Pii側翼Maggy的插入使病原菌在進化過程中具有很大的可塑性，導致無毒基因容易獲得或丟失(Yoshida et al.,2009)。PWL2基因旁側序列中高拷貝或低拷貝的重復性DNA序列如MGR583、MGR586及MGR608(Hamer et al.,1989)的變異導致PWL2的無毒功能喪失(Sweigard et al.,1995)。AVRPiz-t起始密碼子上游462bp處Pot3轉座子的插入使菌株Guy11變為毒性菌株(Li et al.,2009)。AVR-Pita的編碼序列(Zhou et al.,2007)及5'端非編碼序列插入了轉座子Pot3(Dai et al.,2010；Kang et al.,2001)導致無毒功能喪失。這些發現表明，在某些特定條件下，反向元件可以插入基因組，它們可能是植物病理學研究中克服病原體突變的靶標。鑒定新的反轉錄因子并研究它們的活性，將有助于闡明稻瘟病菌致病的本質，為稻瘟病的綜合防控提供思路。