[發(fā)明專利]基于熒光定量PCR技術(shù)的新冠病毒新型核酸突變檢測技術(shù)及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN113025759A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李萬帥;孔祥賓;湯麗麗
• 申請（專利權(quán)）人: 常州國藥醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 常州市權(quán)航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 黃晶晶

本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR技術(shù)的新冠病毒新型核酸突變檢測技術(shù)及其應(yīng)用。本發(fā)明主要基于熒光定量PCR技術(shù)針對目前S基因新突變?雙重變異（E484Q和L452R突變）進行檢測。本發(fā)明提供的試劑盒可以很好的鑒別E484Q和L452R突變，對新冠病毒的新突變快速監(jiān)測具有十分積極的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于熒光定量PCR技術(shù)的新冠病毒新型核酸突變檢測技術(shù)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

自2019年12月起爆發(fā)的新型呼吸系統(tǒng)疾病，截止2021年4月上旬已在全球確診超過一億三千萬例，主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳。經(jīng)分離鑒定，確認其病原為一種新型冠狀病毒，國際病毒分類學委員會將其命名為“SARS-CoV-2”。這是目前在人體中發(fā)現(xiàn)的第七種冠狀病毒，之前主要有6種，其中229E，OC43，NL63，HKU1四種致病性較輕，可引起輕微呼吸道疾病，其余兩種SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒，可引起嚴重呼吸道疾病。

自新冠疫情爆發(fā)以來，新冠病毒突變位點不斷出現(xiàn)，目前多個新冠病毒突變株：譜系B.1.1.7(首先在英格蘭發(fā)現(xiàn))、B.1.351(首先在南非發(fā)現(xiàn))和P1(首先在巴西發(fā)現(xiàn))等，受到全球廣泛關(guān)注。

3月24日，印度衛(wèi)生部發(fā)布聲明稱，在該國的馬哈拉施特拉邦發(fā)現(xiàn)了一種新型變異新冠病毒，該毒株出現(xiàn)了雙重變異，可能會弱化免疫效果且傳染性更強。研究表明來自馬哈拉施特拉邦的病毒樣本上同時出現(xiàn)了E484Q和L452R突變，其特征不同于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒株。印度病毒學家沙希德·賈米爾(Shahid Jameel)表示，這種“雙重突變”病毒有可能在印度發(fā)展出一系列獨立的病毒毒株。目前正在調(diào)查這種新型病毒變體的傳染力及對疫苗效力的影響。當時該邦正經(jīng)歷著新一輪疫情暴發(fā)。而其中的L452R突變則是美國加州北部今年1月初發(fā)現(xiàn)的，在當?shù)貦z出可能帶有突變的病毒株，被認為與當?shù)匾咔橛嘘P(guān)，因此懷疑是是病毒變異造成的傳播力增強。攜帶雙重變異毒株還只存在少數(shù)國家少數(shù)病例中，為防止新型突變病毒擴散，針對新冠病毒最新突變-雙重變異進行檢測，確認是否屬于雙重變異類型，對于病毒監(jiān)測防控具有重要意義。

熒光定量PCR檢測技術(shù)融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性、同一管多重快速檢測的優(yōu)點，是目前臨床檢驗中認同程度很高的一種檢測技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于科學研究和臨床檢測。但目前已上市產(chǎn)品中絕大多數(shù)為普通新冠病毒檢測產(chǎn)品，沒有對新型雙重變異病毒的突變類型進行檢測的試劑盒方法。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光定量PCR技術(shù)的新冠病毒新型核酸突變基因類型檢測試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明一方面提供了一種基于熒光定量PCR技術(shù)的新冠病毒新型核酸突變基因類型檢測試劑盒，所述試劑盒包括以下兩組引物和探針，每個所述探針的兩端分別標記有熒光報告基團/熒光淬滅基團：

a.用于檢測S基因突變類型：序列位置23012，序列變化GC的引物和探針；其中所述引物包括核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的多核苷酸，其中所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

b.用于檢測S基因突變類型：序列位置22917，序列變化TG的引物和探針；其中所述引物包括核苷酸序列分別如SEQ ID No.6SEQ ID No.7所示的多核苷酸，其中所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

新冠病毒的S基因序列參考GenBank:MW533315.1；“雙重變異”基因變異基因序列參考hCoV-19/India/MH-NEERI-NGP-39017/2021。

S基因突變類型：序列位置23012，序列變化GC可以引起S蛋白中E484Q，序列位置22917，序列變化TG可以引起S蛋白L452R。

進一步地，所述試劑盒中還含有用于檢測內(nèi)參基因的引物和探針。