[發(fā)明專利]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt2在肝臟損傷修復(fù)中的作用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110507732.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN115322995A
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張利生;武佳燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N9/10;A01K67/027
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt2作為新的靶點(diǎn)在調(diào)控肝臟損傷修復(fù)及開發(fā)相關(guān)治療藥物中的用途。試驗(yàn)表明，動(dòng)物敲除Dnmt2能加重肝臟損傷，升高丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，增加纖維化指標(biāo)α?Sma及Col1a1的表達(dá)，加重膽汁淤積，且在肝臟發(fā)生損傷后，Dnmt2蛋白會(huì)發(fā)生重新定位，由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。證明Dnmt2在動(dòng)物肝臟損傷修復(fù)及再生中發(fā)揮十分重要的作用，可作為新的藥物靶點(diǎn)，對(duì)治療肝臟損傷的藥物研發(fā)具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt2的作用，尤其是在調(diào)控肝臟損傷修復(fù)中的作用。

背景技術(shù)

1.Dnmt2簡(jiǎn)介

生物體的遺傳特征除了由基因序列決定，甲基化、磷酸化、乙酰化等也是能夠改變基因遺傳功能的方式。其中，甲基化是指在不改變基因序列的基礎(chǔ)上，利用甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基從活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨，SAM)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行修飾，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和沉默，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。

甲基化的的對(duì)象主要包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)，需要的酶也是三種不同的酶，分別是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶(如METTL)與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。其中，哺乳動(dòng)物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族主要包括Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3A、Dnmt3B和Dnmt3L，Dnmt1的功能是維持DNA甲基化，Dnmt3的功能是參與DNA的從頭甲基化，Dnmt2是其中最特殊的一個(gè)成員，它的DNA甲基化功能一直以來(lái)都存在爭(zhēng)議，是否能夠甲基化DNA還未得到確定的答案，但越來(lái)越多的研究都證明了Dnmt2具有甲基化RNA的功能，包括tRNA、micRNA，最近還證明了其能夠甲基化mRNA。Dnmt2之所以被歸類為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，是由于其序列與細(xì)菌的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶具有同源性，同時(shí)還因?yàn)槿祟惖腄nmt2蛋白以及酵母的Pmt1甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域具有相似性。

1998年，Okano M等人發(fā)現(xiàn)在小鼠和人的細(xì)胞存在一個(gè)擁有甲基轉(zhuǎn)移酶功能域的基因，并且和酵母的Pmt1基因具有很高的同源性，因此被命名為Dnmt2。在結(jié)構(gòu)上，Dnmt2與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族其它成員有所不同：Dnmt基因由N末端結(jié)構(gòu)域、C端催化功能域和靶結(jié)合域三個(gè)部分組成，N端結(jié)構(gòu)域能夠?qū)⒚赴邢蚨ㄎ坏郊?xì)胞核和復(fù)制灶，但是Dnmt2缺少N端結(jié)構(gòu)域，保留了催化功能域和靶結(jié)合域。同時(shí)Dnmt2還包含10個(gè)在原核生物和真核生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中保守的序列，包括一致的S-腺苷-L-蛋氨酸結(jié)合基序和活性位點(diǎn)Pro-Cys二肽，也正是因?yàn)槿绱耍珼nmt2被歸入了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族。與此同時(shí)，Dnmt2也是該家族基因中最保守的成員，在幾乎所有物種中都可以找到Dnmt2的同源物，不過值得注意的是Dnmt2缺乏確定的核酸結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)催化基序IV和其他部分催化中心的環(huán)也是無(wú)序的。

Dnmt2存在于原核生物和真核生物中，包括植物、真菌、寄生蟲、昆蟲和哺乳動(dòng)物的基因組中，是在長(zhǎng)期進(jìn)化篩選壓力下保留下來(lái)的基因之一，主要存在于肌肉、發(fā)育中的胚胎內(nèi)臟、卵巢囊腫以及增殖中的睪丸細(xì)胞中。但是，正常情況下，Dnmt2蛋白的表達(dá)水平很低。在斑馬魚中，Dnmt2定位于細(xì)胞質(zhì)，而在果蠅中則存在于胞漿和核內(nèi)，定位顯示大量的Dnmt2結(jié)合于核基質(zhì)處。在小鼠細(xì)胞中觀察Dnmt2的定位，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Dnmt2定位于細(xì)胞核，將GFP-Dnmt2轉(zhuǎn)染鼠源或人源細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞質(zhì)，并且分布不均勻，在許多細(xì)胞中，GFP-Dnmt2會(huì)濃縮成胞質(zhì)灶，且胞質(zhì)灶隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明了Dnmt2會(huì)發(fā)生核質(zhì)穿梭。值得注意的是，Dnmt2的過表達(dá)會(huì)使細(xì)胞致死，在轉(zhuǎn)染12h后，熒光信號(hào)會(huì)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加而急劇減少。還有研究顯示，EGFP-Dnmt2在細(xì)胞分裂S期彌散分布，但在有絲分裂開始后迅速定位于細(xì)胞核，在中期和后期，EGFP-Dnmt2形成紡錘狀結(jié)構(gòu)，并在核運(yùn)動(dòng)期間重新定位至中心體，在隨后的S期中，EGFP-Dnmt2會(huì)分布至整個(gè)合胞體細(xì)胞質(zhì)中，直到下一個(gè)有絲分裂期開始。

2.Dnmt2的功能

(1)甲基化功能