[發明專利]廣陳皮貯藏年限的分子鑒定方法

有效

• 申請號: 202110507207.8
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113278685B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 晁志;李放;李嬋
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈;李玉娜

本發明涉及藥材檢測技術領域，公開了廣陳皮貯藏年限的分子鑒定方法，包括以下步驟：(1)、制備trnL?trnF片段的標準品，通過熒光定量PCR方法進行各稀釋濃度標準品的C_q值的測定，建立trnL?trnF DNA片段的拷貝數對數值與相應C_q值的標準曲線；(2)、提取不同貯存年限廣陳皮的基因組DNA作為模板，通過熒光定量PCR方法測定DNA模板中trnL?trnFDNA片段的C_q值，將不同貯藏年限樣品得到的C_q值代入到步驟(1)的標準曲線，計算出拷貝數對數值；(3)、將不同貯藏年限廣陳皮中trnL?trnF片段所得的拷貝數對數值與貯藏年限進行線性回歸分析，建立基于DNA片段拷貝數判斷不同貯藏年限的廣陳皮的變化曲線。本發明能夠鑒定廣陳皮的貯藏年限，為廣陳皮優質優價提供依據和保障。

技術領域

本發明涉及藥材檢測技術領域，具體涉及廣陳皮貯藏年限的分子鑒定方法。

背景技術

廣陳皮為我國著名道地藥材，來源于茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮，主產于廣東新會，兼具藥食兩用特色，在市場中占據重要地位。

陳皮自古有“陳久者良”一說，至少需要貯藏三年以上才可入藥，貯藏年份越長的廣陳皮價格越高。據報道和調查，時下貯藏3～5年的廣陳皮，價格一般為800元/千克；10年的約為1600元/千克，20年的約為16000元/千克，而25年的是24000元/千克，30年的則達68000元/千克。50年左右的廣陳皮，一般來說不少于20萬元/千克。因此，市場上常有以其它柑橘類的果皮冒充廣陳皮、夸大廣陳皮曬制年份，以貯藏年份較短的廣陳皮冒充高年份陳皮出售的現象出現。

目前，廣陳皮貯藏年限的判斷主要是根據其化學成分的變化規律與貯藏年限的關系進行探討，例如FTIR、GC－MS等分析方法；此外，還有研究者利用分光測色儀研究廣陳皮顏色特征與貯藏年限之間的相關性判斷久貯中藥的貯藏時間。上述研究對新會陳皮年份鑒別有參考意義，但研究樣本少，專屬性欠佳，存在不可控性，未能形成實際應用。

生物材料在貯藏過程中，其中的DNA將逐步降解，其中的某些DNA片段的拷貝數會逐漸減少，與材料貯藏年份之間存在有規律的量－時曲線。而廣陳皮貯藏環境比較穩定且其規范的陳化方式，降解曲線應較為平滑，出現劇烈下降的可能性低。鑒于此，本發明提出用熒光定量PCR的方法對不同貯藏年限廣陳皮中拷貝數表現差異的片段進行測定，提供一種利用分子生物學技術，明確的、可靠的鑒定廣陳皮貯藏年份的客觀方法。

發明內容

為了解決上述背景技術中所提出的問題，本發明的目的是提供一種利用分子生物學技術，明確的、可靠的鑒定廣陳皮貯藏年份的客觀方法。采用熒光定量PCR的方法對不同貯藏年限廣陳皮中trnL-trnF片段進行拷貝數的測定，其拷貝數的對數值與貯藏年限存在顯著相關性，相關系數高達0.9748。這種方法可為廣陳皮優質優價提供依據和保障，切實保護消費者權益；亦可為其它中藥材貯藏時間的確定提供借鑒。

本發明的技術方案是：

本發明提供的廣陳皮貯藏年限的分子鑒定方法，所述方法包括以下步驟：

(1)、制備trnL-trnF片段的標準品，通過熒光定量PCR方法進行各稀釋濃度標準品的C_q值的測定，建立trnL-trnF DNA片段的拷貝數對數與相應C_q值的標準曲線；

(2)、提取不同貯存年限廣陳皮的基因組DNA作為模板，通過熒光定量PCR方法測定DNA模板中trnL-trnFDNA片段的C_q值，將不同貯藏年限樣品得到的C_q值代入到步驟(1)的標準曲線，計算出拷貝數對數值；

(3)、將不同貯藏年限廣陳皮中trnL-trnF片段所得的拷貝數對數值與貯藏年限進行線性回歸分析，建立基于DNA片段拷貝數判斷不同貯藏年限的廣陳皮的變化曲線。