[發明專利]一種利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組、試劑盒、檢測方法

有效

• 申請號: 202110507195.9
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113215314B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 高嵩;馬超;王佩;孫濤;張雪;陳禮戰;楊麗紅
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京寧致知識產權代理有限公司 32520
• 代理人: 耿欣

本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種利用L/RPA快速檢測SARS?CoV?2的探針及引物組、試劑盒、檢測方法。本發明公開的一種利用L/RPA快速檢測SARS?CoV?2的探針及引物組分別為針對N基因和針對ORF1ab基因的探針及引物組；所述針對N基因的探針及引物組包括：探針組：N?Probe2A?3、N?Probe2B?3、引物組N?Primer3F、N?Primer3R；所述針對ORF1ab基因的探針及引物組包括：探針組：O?Probe1A?2、O?Probe1B、引物組O?Primer2F、O?Primer2R，本發明還公開了一種30min內無需逆轉錄步驟即可達到靈敏度與RT?qPCR相當的檢測方法，該方法不僅不依賴儀器設備，反應快速靈敏，操作簡單，且避免了樣本污染，更有望應用于病毒突變株的檢測中。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組、試劑盒、檢測方法。

背景技術

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)已經對全世界人民的健康安全產生嚴重的安全威脅。有效的疫苗，準確的診斷對于控制傳染病至關重要。在現階段基因組學研究深入的前提下，關于新型冠狀病毒的分子診斷技術也獲得了飛速的發展。目前成為臨床分子診斷最主要的檢測方法是逆轉錄熒光定量PCR方法(RT-qPCR)，該方法將冠狀病毒RNA轉錄成為cDNA，并且通過聚合酶鏈式反應對冠狀病毒的生物標志物進行特異性的擴增，最終實現熒光信號的實時檢出。然而，RT-qPCR檢測方法對于實驗室和專業人員的依賴程度非常高，這并不適合在資源匱乏的地區甚至國家進行有效的病毒檢測。為了滿足資源匱乏地區以及早發現早治療的現實需求，利用LAMP、RPA等技術開發的等溫擴增檢測方法也相繼被報道，這些方法在一定程度上減少了檢測時對于設備的依賴性。除此之外，為了使得檢測更靈敏，結果更直觀，側向流試紙條和便攜式熒光檢測儀同樣被應用到了病毒檢測中，這些檢測方法無疑為SARS-CoV-2的分子檢測提供了更多的選擇。

然而，基于PCR、LAMP、RPA技術開發出的分子診斷方法只能夠擴增DNA模板，無法直接擴增RNA模板，因此必須將病毒的RNA逆轉錄成cDNA才能夠進行后續的擴增。眾所周知，RNA很容易受到環境中RNase的污染，而逆轉錄實驗本身對于RNA的濃度和純度要求都很高，這也就直接要求了操作人員不僅需要足夠專業，同樣還需要足夠小心以避免環境對待檢樣本的污染，因此基于逆轉錄步驟的分子檢測方法的應用受到了很大的限制。

為了避免逆轉錄步驟，減少臨床樣本中病毒RNA的損失以及提高檢測的準確度，本項目發明了一種利用連接酶、重組酶聚合酶擴增(L/RPA)快速檢測SARS-CoV-2的試劑盒。本發明針對中國疾控中心報告出的SARS-CoV-2生物標志物N基因和ORF1ab基因分別設計連接探針，這些探針中有一部分與目標基因互補配對，而另一部分能夠促進RPA擴增。當待測樣本中存在病毒RNA時，探針能夠與RNA互補配對，接著在連接酶的作用下兩條探針能夠形成一條完整的DNA鏈，一旦形成完整的DNA鏈，就可以成為RPA擴增的模板，另一組引物組合可以與形成的DNA鏈通過RPA體系進行擴增，如此一來即可避免逆轉錄步驟，并且在RPA擴增體系內加入SYBR Green I染料即可實現熒光信號的實時讀取。

發明內容

本發明旨在提供一種不依賴儀器設備，反應快速靈敏，操作簡單，且可以避免樣本污染的L/RPA檢測方法，且提供了該方法所用的探針組及引物組，并進一步探索了最佳檢測體系。

為了實現上述目的，本發明具體采用如下技術方案：一種利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組，所述的檢測探針及引物組分別為針對N基因和針對ORF1ab基因的探針及引物組；

所述針對N基因的探針及引物組包括：探針組：N-Probe 2A-3、N-Probe 2B-3、引物組N-Primer 3F、N-Primer 3R；

所述針對ORF1ab基因的探針及引物組包括：探針組：O-Probe 1A-2、O-Probe 1B、引物組O-Primer 2F、O-Primer 2R；