[發明專利]一種利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組、試劑盒、檢測方法

有效

• 申請號: 202110507195.9
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113215314B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 高嵩;馬超;王佩;孫濤;張雪;陳禮戰;楊麗紅
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京寧致知識產權代理有限公司 32520
• 代理人: 耿欣

1.一種利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組，其特征在于，所述的檢測探針及引物組分別為針對N基因和針對ORF1ab基因的探針及引物組；

所述針對N基因的探針及引物組包括：探針組：N-Probe 2A-3、N-Probe 2B-3、引物組N-Primer 3F、N-Primer 3R；

所述針對ORF1ab基因的探針及引物組包括：探針組：O-Probe 1A-2、O-Probe 1B、引物組O-Primer 2F、O-Primer 2R；

所述N-Probe 2A-3序列為SEQ ID NO.5所示的序列；

所述N-Probe 2B-3序列為SEQ ID NO.8所示的序列；

所述O-Probe 1A-2序列為SEQ ID NO.18所示的序列；

所述O-Probe 1B序列為SEQ ID NO.19所示的序列；

所述N-Primer 3F序列為SEQ ID NO.14所示的序列；

所述N-Primer 3R序列為SEQ ID NO.16所示的序列；

所述O-Primer 2F序列為SEQ ID NO.26所示的序列；

所述O-Primer 2R序列為SEQ ID NO.27所示的序列；

所述探針N-Probe 2A-3的5’端帶有磷酸基團；所述探針O-Probe 1A-2的5’端帶有磷酸基團。

2.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1所述的利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的探針及引物組。

3.一種非診斷目的的利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，非診斷目的的利用L/RPA快速檢測的方法包括如下步驟：

（1）將RNA模板與權利要求1所述的針對N基因的探針組或針對ORF1ab基因的探針組加熱至85℃~95℃并保持40s~80s得到混合物；

（2）將混合物冷卻，使探針組與RNA模板退火形成雜合鏈；

（3）加入T4 DNA連接酶和T4 DNA連接酶緩沖液，并且在37℃下連接8-10 min后升溫至95℃，2 min后失活T4 DNA連接酶得到連接產物，所述T4 DNA連接酶的添加量為500 U/5μL反應體系；

（4）向RAA反應管中加入連接產物、權利要求1所述的針對N基因的引物組或針對ORF1ab基因的引物組、A 緩沖液、B 緩沖液、核酸熒光染料，將RAA反應管置于實時熒光定量PCR儀器中，檢測溫度37℃，檢測間隔20 s，檢測時間15 min。

4.根據權利要求3所述的非診斷目的的利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述核酸熒光染料選自SYBR Green I熒光染料。

5.根據權利要求3所述的非診斷目的的利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述RNA模板與探針組的體積比為：3：1。

6.根據權利要求3所述的非診斷目的的利用L/RPA快速檢測SARS-CoV-2的方法，其特征在于，所述非診斷目的的利用L/RPA快速檢測的體系包括連接體系和RPA擴增體系；

所述連接體系，以5μL計，包括：

RNA模板：3μL

針對N基因或針對ORF1ab基因的探針組：各探針濃度0.1~10μM，各探針體積0.5 μL

T4 DNA連接酶：0.5 μL

T4 DNA連接酶緩沖液：0.5 μL

最后獲得5 μL的連接產物；

所述RPA擴增體系，以50μL計，包括：

針對N基因的引物組或針對ORF1ab基因的引物組：各引物濃度10 μM 、正反引物各2 μL

A 緩沖液：36 μL

B 緩沖液：2.5 μL

核酸熒光染料：2.5 μL

連接體系所得連接產物：5 μL。