[發(fā)明專利]一種靶向敲除HBx蛋白的質粒及其構建方法和應用

在審

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• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113293179A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設計）人: 周俊;王臘;孫丹丹;鄧洋;丁士杰
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/51;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 張杰

本發(fā)明提出了一種靶向敲除HBx蛋白的pCMVHBV?HBx(?)質粒以及質粒的構建方法，構建方法步驟以下：以pCMVHBV質粒為模板，設計HBx的CDS突變型引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠回收，孵育，大腸桿菌轉化，測序驗證得到pCMVHBV?HBx(?)質粒。本發(fā)明的pCMVHBV?HBx(?)質粒可以靶向敲除HBx蛋白，顯著抑制pgRNA和cccDNA的形成。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種靶向敲除HBx蛋白的質粒及其構建方法應用。

背景技術

乙肝病毒(HBV)是一種肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纖維化和肝癌嚴重危害著人類的健康。全球約3.5億人感染乙肝病毒，其中亞洲占約 3/4。乙肝病毒核衣殼內的乙肝病毒基因組是含有不完全雙鏈的DNA(rcDNA)，在病毒感染人肝細胞后，隨著核衣殼脫去，rcDNA會入核并經由修補機制形成共價閉合環(huán)狀的DNA(cccDNA)。cccDNA可經由宿主RNA聚合酶II轉錄出包括乙肝病毒病毒前基因組RNA(pgRNA)在內的多條長短不一的乙肝病毒 RNA，病毒蛋白即以此些RNA作為模板進行翻譯，其中pgRNA還可以作為模板通過逆轉錄生成rcDNA，進而包裝入病毒核衣殼蛋白而進入新的一輪復制周期。正是由于cccDNA在乙肝病毒復制過程中作為DNA-RNA-DNA模板以及 cccDNA和pgRNA很難徹底于肝內清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再發(fā)及治療停止耐藥中扮演重要角色。

乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白(HBx)，是一種多功能病毒調節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉錄調控作用，并能與宿主細胞的多種蛋白質直接作用，從而調節(jié)基因表達及宿主細胞蛋白質功能，進而影響病毒的復制、宿主細胞信號轉導、細胞增殖與分化、細胞凋亡及癌變等。

當前，用于治療慢性乙型肝炎患者的藥物主要有干擾素和核苷類似物，但這兩種治療存在耐藥性以及副反應大等問題，且不能達到徹底清除病毒pgRNA 和cccDNA這一理想的治療目標，一旦停藥，患者又有再次發(fā)病的風險，因此，探索特異性靶向敲除HBx蛋白，抑制pgRNA和cccDNA表達的質粒以及藥物，具有非常重要的應用價值。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明提出了一種特異性靶向敲除HBx蛋白，抑制pgRNA和 cccDNA表達的質粒。

第一，本發(fā)明提供了一種靶向敲除HBx蛋白的質粒，所述質粒為 pCMVHBV-HBx(-)，所述質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二，本發(fā)明提供了一種靶向敲除HBx蛋白的質粒的構建方法，包括以下步驟：以pCMVHBV質粒為模板，加入HBx的CDS突變型引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠回收，孵育，大腸桿菌轉化，測序驗證得到pCMVHBV-HBx(-) 質粒。

在以上技術方案的基礎上，優(yōu)選的，所述引物是由HBx的CDS區(qū)域編碼第六位蛋白的堿基突變而成。

在以上技術方案的基礎上，優(yōu)選的，所述HBx的CDS區(qū)域編碼第六位蛋白的堿基突變是密碼子TGC突變?yōu)榻K止密碼子TGA。

在以上技術方案的基礎上，優(yōu)選的，所述引物包括一個正向引物和一個反向引物，其中：

正向引物序列：5’-CTGTGATGCCAACTGGATCCTGCG-3’；

反向引物序列：5’-GCATCACAGCCTAGCAGCCAT-3’。

在以上技術方案的基礎上，優(yōu)選的，所述PCR擴增體系包括：正向引物、反向引物和pCMVHBV，其中正向引物、反向引物和pCMVHBV的體積比為正向引物:反向引物:pCMVHBV＝5:5:4；所述PCR反應程序為：98℃預變性30sec， 98℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，98℃預變性30sec，72℃徹底延伸3min，變性-退火-延伸程序重復循環(huán)25次。