[發(fā)明專利]一種檢測miRNA-198的熒光殼聚糖纖維及其制備方法

有效

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• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113235188B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余躍;馮宵暉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825;D01F9/00;C08B37/08;C09K11/06
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責(zé)任公司 11251
• 代理人: 李曉莉

本發(fā)明提供了一種檢測miRNA?198的熒光殼聚糖纖維及其制備方法。本方法是基于目標(biāo)分子miRNA?198催化hairpin探針自組裝，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，將通過雙鏈雜交反應(yīng)接上熒光殼聚糖纖維的帶有淬滅基團BHQ1的DNA探針probe2從熒光殼聚糖纖維上取代下來，從而使殼聚糖纖維端頭光波導(dǎo)由淬滅轉(zhuǎn)而恢復(fù)，根據(jù)不同濃度的miRNA?198會使得熒光殼聚糖纖維端頭熒光強度的變化不同來實現(xiàn)對miRNA?198進行定量檢測。該檢測方法，對miRNA?198顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及miRNAs的檢測分析技術(shù)，具體涉及一種檢測miRNA-198的熒光殼聚糖纖維及其制備方法。

背景技術(shù)

miRNA是內(nèi)源的微小非編碼RNA，可調(diào)節(jié)基因表達并在各種癌癥的發(fā)生，發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用換言之，它們作為致癌的miRNA(oncomiR)或腫瘤抑制的miRNA(tsmiRNA)，其調(diào)節(jié)許多腫瘤的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖和凋亡，血管生成，侵入，遷移和轉(zhuǎn)移通過具體的目標(biāo)和分子途徑。已在PDAC患者中發(fā)現(xiàn)了幾種miRNA失調(diào)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)許多可能在PC的啟動，進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用的miRNA，應(yīng)將其視為PC的早期診斷，預(yù)后和有益治療的潛在生物標(biāo)志物。其中miRNA-198在胰腺癌患者中的表達顯著升高，可以作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。

傳統(tǒng)的Northern印跡和原位雜交檢測技術(shù)費力且缺乏靈敏度。芯片技術(shù)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)等新技術(shù)雖然功能強大，但由于其復(fù)雜性，仍然僅限于中央實驗室。因此，迫切需要開發(fā)簡便的技術(shù)來檢測miRNA的水平。

經(jīng)典基因和腫瘤標(biāo)志物檢測分別主要基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。盡管PCR和ELISA是靈敏的方法，但它們昂貴，費時，并且需要訓(xùn)練有素的人員以及嚴(yán)格的實驗條件。因此，迫切需要一種低成本，測定時間短，靈敏度高，易于使用且專用的工具來檢測PanIN和早期診斷PDAC。

生物傳感器旨在通過將生物識別事件基本上轉(zhuǎn)換為可以檢測和分析的可測量信號對特定的生物分析物進行定性和半定量。典型的生物傳感器由識別元件，換能器和信號處理單元(信號輸出)組成。熒光生物傳感器是靈敏，特異且具有成本效益的設(shè)備，可以直接評估體液，例如血液，血清，尿液，唾液等。然而目前熒光檢測仍然存在一些困境，例如背景信號泄露嚴(yán)重，光漂白，與背景熒光光譜相重疊等等。因此開發(fā)一種新型的熒光傳感器系統(tǒng)，能夠快速、高選擇性和高靈敏度地進行miRNA的檢測仍然是一項非常有意義的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種檢測miRNA-198的熒光殼聚糖纖維及其制備方法，制備一維熒光殼聚糖纖維，并結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理、CHA放大原理、toehold調(diào)控的鏈替換反應(yīng)及濃縮富集效應(yīng)等，設(shè)計靈敏度高、特異性強的新型生物傳感器用于在復(fù)雜的生物環(huán)境中微量miRNA的檢測。

本發(fā)明提供了一種BHQ1修飾的熒光殼聚糖纖維對于胰腺癌相關(guān)microRNA-miRNA-198的微量檢測方法。該方法基于目標(biāo)分子miRNA-198催化hairpin探針組裝，形成雙鏈結(jié)構(gòu)并進行循環(huán)放大，通過toehold取代熒光殼聚糖纖維上帶有淬滅基團BHQ1的probe2，從而使微米管端頭光波導(dǎo)由淬滅轉(zhuǎn)而恢復(fù)。隨著反應(yīng)循環(huán)進行，低濃度的目標(biāo)miRNA-198就可產(chǎn)生高的信號，而的單堿基變異，三堿基變異以及其他microRNA產(chǎn)生極低的信號。該檢測方法，對miRNA-198顯示了極高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：