[發明專利]一種抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片及其制備方法與在選擇性分離單個循環腫瘤細胞中的應用

在審

• 申請號: 202110506141.0
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113340859A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 劉威;陳貝
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12M1/00;C12N5/09
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

本發明公開了一種抗體?明膠納米顆粒修飾的芯片及其制備方法與在選擇性分離單個循環腫瘤細胞中的應用，所述方法包括：將明膠納米顆粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，獲得NHS基團功能化明膠納米顆粒；將玻片于APTES無水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗滌，獲得胺化處理玻片；將所述NHS功能化明膠納米顆粒于所述胺化處理玻片上反應，獲得明膠納米顆粒修飾的玻璃基板；將所述明膠納米顆粒修飾的玻璃基板的表面修飾抗Epcam抗體，獲得的抗體?明膠納米顆粒修飾的芯片，可以捕獲多個循環腫瘤細胞，并通過水凝膠的選擇性光固化實現單個循環腫瘤細胞分離，避免了鄰近細胞的干擾，保證了基因檢測的純度和準確性。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，特別涉及一種抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片及其制備方法與在選擇性分離單個循環腫瘤細胞中的應用。

背景技術

循環腫瘤細胞(CTCs)由于攜帶腫瘤患者的基因，是人類外周血中腫瘤轉移的種子，可通過血液循環引起腫瘤增殖。作為腫瘤標志物，CTC可為腫瘤的早期診斷、臨床治療和術后療效評價提供必要的依據。因此，近年來開發了多種CTCs分離平臺。目前分離CTC的主要原理是基于細胞的物理性質、免疫磁珠、微流控器件、功能性質等。但需要注意的是，上述方法不可避免地分離出非靶向細胞。根據調查,主要的釋放方法是通過外部刺激將捕獲的細胞作為一個整體釋放,然而，這樣子收集的細胞可能含有非靶向細胞,這將導致CTC后續的基因檢測結果可能不單單是CTC的結果.這就可能會導致有一個不準確的結果分析。因此，迫切需要開發一種單細胞釋放平臺來保證下游分析的準確性。近年來，許多單CTC基因突變分析被報道。據報道，單個CTC的分離方法有很多種，例如:顯微操作、流式細胞術、激光捕獲顯微解剖、介質電泳分離等。

然而，現有技術中的這些方法都受到時間成本、操作復雜和效率低的限制，因此它們在CTC中的應用仍然有限。例如，激光切割分離單個CTC時，往往會將CTC從整個基底中剝離出來，這可能會因為基底的切割而干擾進一步的分析。還有一些其他的釋放方法，比如通過外部刺激反應選擇性釋放單一的CTC,然而，這些不可避免的需要清洗步驟，這將導致細胞丟失，同時可能收集了靶向細胞和非靶向細胞，導致基因測試不準確。目前很難在不損失的情況下收集單個的CTC。維持細胞的高活性對于后續的細胞分析是至關重要的，有效的單細胞恢復平臺能夠保持細胞活力，對單個CTC的遺傳分析是必要的。

因此，如何開發一種從患者血液中捕獲并分離出活性較高的單個CTCs且效率高準確性高的方法或者材料工具，成為亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明目的是提供一種抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片及其制備方法與在選擇性分離單個循環腫瘤細胞中的應用，該抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片可以捕獲多個循環腫瘤細胞，再結合光固化水凝膠，可以從患者血液中分離出活性較高的單個CTCs，同時避免了鄰近細胞的干擾，保證了基因檢測的純度和準確性。

在本發明的第一方面，提供了一種抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片的制備方法，所述方法包括：

將明膠納米顆粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，獲得NHS功能化明膠納米顆粒；

將玻片于APTES無水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗滌，獲得胺化處理玻片；

將所述NHS功能化明膠納米顆粒置于所述胺化處理玻片上反應，獲得明膠納米顆粒修飾的玻璃基板；

將所述明膠納米顆粒修飾的玻璃基板的表面修飾抗Epcam抗體，獲得抗體-明膠納米顆粒修飾的芯片。

進一步地，所述EDC/NHS溶液為將(3.5～4.5)mg/mL EDC和(5.5～6.5)mg/mL NHS溶解在(0.05～0.15)M的MES溶液中配制而得。

進一步地，所述APTES無水乙醇中APTES的質量分數為4～6％；所述乙醇溶液的質量分數為70～90％。