[發(fā)明專利]一種多重巢式PCR方法

在審

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• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113186286A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設計）人: 鐘晟;胡新蕾;嚴曉芹;閆子玥
• 申請（專利權(quán)）人: 成都泰萊醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市優(yōu)賽朝聞專利代理事務所(普通合伙) 44454
• 代理人: 譚育華

一種多重巢式PCR方法，涉及基因標志物檢測技術(shù)領域，本發(fā)明利用多重PCR和巢式PCR相結(jié)合，利用4種目的基因的基因標志物，設計全新的PCR引物，針對cfDNA5hmC富集捕獲文庫，使用touchdownPCR及熱啟動PCR方法進行多重巢式PCR擴增，避免PCR過程中引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，保證了PCR擴增的特異性，進而完成靶序列的富集，得到二代測序靶向測序文庫；通過對4個目的基因的羥甲基化狀態(tài)的高效檢測，實現(xiàn)在較低測序深度下完成對基因標志物中5hmC含量的檢測，從而大幅降低測序成本，成為一種高效率、低成本的肝癌早期診斷檢測手段。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及基因標志物檢測技術(shù)領域，尤其涉及一種多重巢式PCR方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的臨床檢測技術(shù)，主要是通過血清學腫瘤標志物和影像學方法進行檢測。目前，臨床上通常以使用檢查血液中甲胎蛋白(AFP)含量、異常凝血酶原(DCP)，以及超聲檢查和CT檢查為主。然而，這些檢測方法分別具有如下一些明顯的缺陷。血清學指標AFP和DCP，這兩者靈敏度都較低，分別為不足60％和44％；而且，AFP水平也極易因懷孕或其他疾病等因素而升高，這將使得檢測結(jié)果假陽性率偏高。此外，影像學診斷方法則對設備有較高依賴性，同時，操作者經(jīng)驗對其操作也會產(chǎn)生影響，極易出現(xiàn)漏診。這將導致大部分患者在早期沒有得到及時確診而失去最佳治療時期，失去了早發(fā)現(xiàn)早治療的機會。

目前，研究已證實HCC患者血漿游離DNA羥基化(5hmC)檢測，在HCC早期診斷中取得了令人振奮的進步，但是在實際操作中存在以下局限性：1、目前DNA羥甲基化的主要研究手段常為基于二代測序的方法，其操作繁瑣，且測序費用昂貴；2、目前基于二代測序的檢測方法，對測序深度要求較高，耗時較長，不易于患者盡快拿到診斷結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

(一)發(fā)明目的

為解決背景技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種多重巢式PCR方法。本發(fā)明利用多重PCR和巢式PCR相結(jié)合，利用4種目的基因的基因標志物，設計全新的PCR引物，避免PCR過程中引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，并使用外部引物和內(nèi)部引物組合的兩輪PCR方法，保證了PCR擴增的特異性；通過對4個目的基因的羥甲基化狀態(tài)的高效檢測，實現(xiàn)在較低測序深度下完成對基因標志物中5hmC含量的檢測，從而大幅降低測序成本，成為一種高效率、低成本的肝癌早期診斷檢測手段。

(二)技術(shù)方案

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種多重巢式PCR方法，包括4種目的基因LDAH、MSL2、LFNG、MAD1L1、GATAD2A、CASZ1、SUFU、RAD51B和CAMTA1的引物組；引物組包括內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物,其中內(nèi)側(cè)引物序列包含測序接頭序列；

外側(cè)引物的核酸序列包括：

1-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGCAAAGAGTCAGTG；

2-PCR-NGS-F1：TTCCCTTTGGCAGAGGCAGCAG；

3-PCR-NGS-F1：TTTGGTTGGAAGAGGAGGCT；

4-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGGAAAGAGTCAGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA；

內(nèi)側(cè)引物的核酸序列包括：

P5-1-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCTTCCACTGGCTTCAGGACTGACGCC；

P5-2-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGGCTTCAGCCCATGGAGCGGGTAG；