[發明專利]一種多重巢式PCR方法

在審

• 申請號: 202110504701.9
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113186286A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 鐘晟;胡新蕾;嚴曉芹;閆子玥
• 申請（專利權）人: 成都泰萊醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市優賽朝聞專利代理事務所(普通合伙) 44454
• 代理人: 譚育華

1.一種多重巢式PCR方法，其特征在于，包括含4種目的基因C C2orf43、GPR132、RP11-405A12.2以及一個基因間區域的引物組；引物組包括內側引物和外側引物，其中內側引物序列包含二代測序接頭序列；

外側引物的核酸序列包括：

1-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGCAAAGAGTCAGTG；

2-PCR-NGS-F1：TTCCCTTTGGCAGAGGCAGCAG；

3-PCR-NGS-F1：TTTGGTTGGAAGAGGAGGCT；

4-4-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGGAAAGAGTCAGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA；

內側引物的核酸序列包括：

P5-1-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCTTCCACTGGCTTCAGGACTGACGCC；

P5-2-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGGCTTCAGCCCATGGAGCGGGTAG；

P5-3-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAACCGGTAGGCTCTATAGAAATAGCAGCA；

P5-4-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTTGTAGCAGCAGGAGGCCCGGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA。

2.根據權利要求1所述的一種多重巢式PCR方法，其特征在于，步驟如下：

a1、提取血漿游離DNA；

a2、將cfDNA片段進行末端修復并補齊；

a3、將末端補齊的DNA與短接頭進行連接，得到連接產物；

a4、將N3(疊氮)修飾葡萄糖基團轉移至5hmC,然后采用點擊化學的方法捕獲含有糖基化修飾的序列；

a5、依次采用外側引物組合和內側引物組合進行兩輪PCR擴增后，進行低深度二代測序檢測。

3.一種包括權利要求1-2任一項所述的多重巢式PCR方法的應用，其特征在于，應用于肝癌早期診斷，診斷步驟如下：

b1、血漿游離DNA提取：取受試者血漿2ml提取得到DNA溶液50μL；

b2、對提取的cfDNA片段進行末端修復并補齊；

b3、將短接頭連接至末端補齊的DNA；

b4、通過葡糖基轉移酶T4-β-GT，將含疊氮修飾基團的糖UDP-6-N3-glucose的修飾基團轉移到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上；

b5、在疊氮基團標記的5-羥甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基環辛炔-四聚乙二醇；

b6、將含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段結合在固相材料鏈霉親和素免疫磁珠上；

b7、利用緩沖液多次洗滌固相材料去除未結合的DNA片段；

b8、以結合在鏈霉素親和素免疫磁珠上的DNA為模板，依次采用外側引物組合和內側引物組合引物組，進行兩輪PCR擴增；

b9、用1.5x的AmpureXP beads純化擴增產物，獲得最終測序文庫；

b10、使用Qubit對獲得的測序文庫進行濃度測定，并使用LabChip GX Touch對文庫DNA片段大小含量進行確定，將文庫按相同濃度混勻，根據二代測序儀器使用標準方法進行上機測序。

4.根據權利要求3所述的一種多重巢式PCR方法的應用。