[發明專利]雞DF-1細胞IHH基因敲除穩定細胞株的構建方法及其特異性sgRNA

在審

• 申請號: 202110503416.5
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113151277A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 金四華;徐媛;稅斐;耿照玉;何培莉;高偉鳳;夏晶晶;賈羽晴;江洪峰;鄭書麗
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/66;C12R1/91
• 代理公司: 合肥中谷知識產權代理事務所(普通合伙) 34146
• 代理人: 洪玲

本發明涉及一種雞DF?1細胞IHH基因敲除穩定細胞株的構建方法及其特異性sgRNA，本發明最核心最關鍵的技術是構建靶向雞IHH基因的合理有效的sgRNA，將sgRNA與CRISPR/Cas9基因敲除載體結合，通過脂質體轉染的方式轉入雞DF?1細胞，沉默IHH基因表達，再通過流式分選獲得單克隆細胞，即為雞DF?1細胞IHH基因敲除穩定細胞株。通過本發明成功構建了一種基于CRISPR/Cas9方法建立敲除雞IHH基因的方法，獲得靶向雞IHH的sgRNA和IHH基因敲除DF?1陽性單克隆細胞株。本發明構建的雞IHH基因敲除細胞系可用于后續對IHH基因功能的相關研究，為雞匍匐性狀研究提供了一個細胞模型，為后續基因功能進一步研究奠定基礎。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術領域，具體涉及雞DF-1細胞IHH基因敲除穩定細胞株的構建方法及其特異性sgRNA。

背景技術

CRISPR/Cas9基因編輯技術是目前廣泛應用于動植物基因編輯的技術，主要由CRISPR基因座、Cas基因和轉化活化RNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)組成(Jansenet al.,2002)。CRISPR/Cas9系統因其組成成分簡單，能靶向結合DNA對目標序列進行定點敲除等優點，廣泛應用于基因編輯技術方面(Zhang et al.,2019；Tang et al.,2021)。向導RNA(guide RNA,gRNA)由一段約20bp的核苷酸序列組成，引導Cas9蛋白到目標序列的特定位點，Cas9蛋白通常在PAM序列的前三個堿基處開始切割造成雙鏈DNA斷裂，而細胞內存在DNA損傷自我修復機制，利用修復機制增加或減少堿基數，改變原有序列，從而進行基因編輯(Mohammadzadeh et al.,2020；Ahmed et al.,2020；Hsu et al.,2014)。

印度刺猬因子(Indian hedgehog，IHH)作為HH(Hedgehog)蛋白家族中的一員，主要在軟骨組織和腸道中表達，不僅在胚胎骨骼發育過程和終生長板中調節軟骨細胞的分化和增殖，對出生后機體的骨骼發育過程也有重要調控作用，其作為骨骼發育的中樞調控因子，主要調節軟骨生長和分化，關節發育和骨形成等(Samsa et al.,2017；Ma et al.,2011；Karp et al.,2000)。全基因組測序技術發現IHH基因是引起雞匍匐性狀(Cp)的致因基因，而IHH缺失會引起軟骨營養不良，并且在匍匐型雞(Cp/+)雜合子中軟骨細胞成熟延遲。IHH缺失導致雞軟骨發育異常，是造成雞匍匐性狀的突變原因，且純合的基因型造成雞胚胎早期死亡(Jin et al.,2016)。但目前對雞IHH基因功能報道還不足。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術構建敲除雞IHH基因的細胞系，獲得敲除IHH基因的陽性單克隆細胞株，用于后續研究雞IHH基因功能及作為進一步研究雞IHH基因對雞匍匐性狀的影響建立細胞模型。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供雞DF-1細胞IHH基因敲除穩定細胞株的構建方法及其特異性sgRNA。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：

一種用于雞DF-1細胞IHH基因敲除的sgRNA組合，所述sgRNA組合包括如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互補序列，或包括如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列或其互補序列。

一種上述sgRNA組合在IHH基因功能研究中的應用。

一種用于雞DF-1細胞IHH基因敲除的載體，所述載體為包含Cas9蛋白編碼基因序列和上述sgRNA組合序列的CRISPR/Cas9基因敲除系統載體。

進一步改進在于，所述載體為包含Cas9蛋白編碼基因序列和上述sgRNA組合序列的PX458載體。