[發(fā)明專利]雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其特異性sgRNA

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110503416.5
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113151277A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金四華;徐媛;稅斐;耿照玉;何培莉;高偉鳳;夏晶晶;賈羽晴;江洪峰;鄭書麗
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/66;C12R1/91
• 代理公司: 合肥中谷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34146
• 代理人: 洪玲

1.一種用于雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除的sgRNA組合，其特征在于，所述sgRNA組合包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或包括如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。

2.一種如權(quán)利要求1所述的sgRNA組合在IHH基因功能研究中的應(yīng)用。

3.一種用于雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除的載體，其特征在于，所述載體為包含Cas9蛋白編碼基因序列和如權(quán)利要求1所述的sgRNA組合序列的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述載體為包含Cas9蛋白編碼基因序列和如權(quán)利要求1所述的sgRNA組合序列的PX458載體。

5.一種雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株為利用雞DF-1細(xì)胞制備出的雞DF-1細(xì)胞IHH基因第二外顯子缺失型穩(wěn)定株，所述細(xì)胞株中突變的IHH基因序列為基于CRISPR/Cas9方法、并利用如權(quán)利要求1所述的sgRNA組合特異性敲除獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株，其特征在于，所述雞DF-1細(xì)胞IHH基因第二外顯子具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

7.一種如權(quán)利要求5所述的雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)根據(jù)雞IHH基因的第二外顯子區(qū)域序列設(shè)計敲除靶點，獲得如權(quán)利要求1所述的用于雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除的sgRNA組合；

(2)構(gòu)建含有步驟(1)所述sgRNA組合的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)載體，命名為IHH-Cas9敲除重組載體；

(3)將步驟(2)獲得的IHH-Cas9敲除重組載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入雞DF-1細(xì)胞，沉默IHH基因表達(dá)；

(4)通過流式分選獲得單克隆細(xì)胞，即為雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)的載體構(gòu)建方法為：人工合成含有酶切位點的sgRNA序列，經(jīng)退火形成雙鏈DNA；將CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)載體進(jìn)行雙酶切，獲得線性化的Cas9載體；將退火的雙鏈DNA與線性化的Cas9載體連接，獲得有活性的IHH-Cas9敲除重組載體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，在獲得有活性的IHH-Cas9敲除重組載體后用引物對重組載體進(jìn)行測序，并提取測序正確的重組載體，所用引物的序列為5’-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3’。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種雞DF-1細(xì)胞IHH基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述酶切位點為Bbs I酶切位點。