[發明專利]一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法

有效

• 申請號: 202110500285.5
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113234704B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 葛新建;馬麗娜
• 申請（專利權）人: 上海碧云天生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明提供了一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：將粘質沙雷氏菌核酸酶的編碼核酸與突變型SUMO3標簽的編碼核酸進行融合表達，分離獲得粘質沙雷氏菌核酸酶。本發明通過優化原核表達提高了蛋白的產量；通過SUMO3的突變改造，提高了重組粘質沙雷氏菌核酸酶的復性率和均一性。同時，本發明也簡化了純化步驟，降低了生產成本，適合重組粘質沙雷氏菌核酸酶的大規模工業生產。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域；更具體地，涉及一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法。

背景技術

核酸酶是可以切割核酸核苷酸亞單位之間磷酸二酯鍵的酶。在遺傳機制的很多方面發揮著重要作用，包括參與避免突變(DNA修復、復制和重組)、清除生長和代謝過程中產生的多余核苷酸和磷酸鹽、防御外來的核酸分子、細胞程序性死亡和感染；在食品工業中核酸酶可用于生產核酸增味劑，如單磷酸鳥苷、單磷酸肌苷等；在醫藥工業中核酸酶用于生產其它核苷酸、疫苗和基因治療產品。

核酸酶按底物特異性可分為兩類：糖類特異性核酸酶(脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)和降解DNA、RNA的糖類非特異性核酸酶。在所有非特異性核酸酶中，來源于粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸內切酶能水解各種形式的DNA和RNA(單鏈、雙鏈、線性和環形)，生成5’-磷酸單核苷酸和5’-磷酸寡核苷酸終產物，對核酸的序列沒有嚴格要求，沒有蛋白酶活性。該核酸內切酶的應用較多，可以有效去除重組蛋白中的核酸污染；去除病毒疫苗和基因治療病毒載體生產中的核酸污染，使其符合FDA指南中核酸含量的要求；可以用于實時定量PCR測定重組病毒滴度；降低由核酸導致細菌或細胞裂解液的高粘度使其易于過濾，有保護蛋白純化柱的功效；防止細胞成團；提高包涵體蛋白復性率；在二維凝膠電泳中提高蛋白質分離效率和雙向電泳的分辨率等。

來源于粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸酶由266個氨基酸組成，與其它革蘭氏陰性菌不同，1-21氨基酸組成的信號肽幫助核酸酶分泌到培養基中，其它革蘭氏陰性菌的蛋白質被分泌到質膜空間而不是周圍的培養基，在分泌過程中信號肽(1-21氨基酸)被切除；具有水解核酸酶活性的22-266氨基酸部分被分泌到培養基中，分子量約為26.7kDa。研究發現在粘質沙雷氏菌中將核酸酶分泌到培養基中信號肽(1-21氨基酸)是必須存在的，但是在大腸桿菌中表達重組粘質沙雷氏菌核酸酶即使沒有信號肽(1-21氨基酸)，重組粘質沙雷氏菌核酸酶也可以被分泌到培養基中。

現有的方法中，雖然重組粘質沙雷氏菌核酸酶在大腸桿菌中分泌表達，但是依舊約有50％的重組粘質沙雷氏菌核酸酶無法被分泌到培養基中(詳見發明專利US5173418A)，使其產量嚴重受限，且留在胞內的重組粘質沙雷氏菌核酸酶具有水解大腸桿菌基因組的能力，損傷大腸桿菌基因組，進一步限制了重組粘質沙雷氏菌核酸酶的產量，因此重組粘質沙雷氏菌核酸酶的產量較低，即使采用高密度細菌發酵的方法，也仍需處理幾十至幾百升的培養基上清，增加重組粘質沙雷氏菌核酸酶的生產時間和成本。此外，例如US5173418A的方案，其構建質粒不帶有純化標簽，無法采用快速、高效的親和層析純化方法，只能采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和排阻層析等多步驟純化方法，致使純化步驟繁瑣、生產耗時長。現有的其他一些表達方法中，雖然通過在重組蛋白的N端和C端引入標簽提高純化效率，但是無法完全切除標簽，重組生產獲得的粘質沙雷氏菌核酸酶與天然沙雷氏菌的核酸酶氨基酸序列存在差異。

綜上所述，現有制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶發明專利存在蛋白產量低、蛋白不均一、純化步驟繁瑣、生產耗時長和生產成本高等問題亟待解決。

發明內容

本發明的目的在于提供一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法。

在本發明的第一方面，提供一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：將粘質沙雷氏菌核酸酶的編碼核酸與突變型SUMO3標簽的編碼核酸進行融合表達，分離獲得粘質沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突變型SUMO3標簽，其第47位由Cys突變為Ser。