[發明專利]一種制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法

有效

• 申請號: 202110500285.5
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113234704B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 葛新建;馬麗娜
• 申請（專利權）人: 上海碧云天生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種在大腸桿菌中制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶的方法，其特征在于：將粘質沙雷氏菌核酸酶的編碼核酸與突變型SUMO3標簽的編碼核酸進行融合表達，分離獲得粘質沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突變型SUMO3標簽，其第47位由Cys突變為Ser, 所述突變型SUMO3標簽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；融合表達時，所述的突變型SUMO3標簽位于N端，所述粘質沙雷氏菌核酸酶位于C端，所述的粘質沙雷氏菌核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變型SUMO3標簽的N端還包括His標簽。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，以大腸桿菌進行表達，誘導溫度37±2℃，0.5±0.2mM IPTG，誘導表達12±4小時。

4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，以大腸桿菌進行表達，獲得融合蛋白包涵體后，還包括：包涵體變性、復性和純化的步驟；所述的純化步驟中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分離獲得所述粘質沙雷氏菌核酸酶。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述SUMO蛋白水解酶為SUMO特異性蛋白酶2。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括分別利用清洗液、溶解液以及復性液對融合蛋白包涵體進行清洗、溶解以及復性的步驟。

7.權利要求6所述方法，其特征在于，所述清洗液包括：10-50mM三羥甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100；和/或

所述溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM二硫蘇糖醇；和/或

所述復性液包括：0.2-2M L-精氨酸，10-200mM三羥甲基氨基甲烷pH8.0，1-10mM還原型谷胱甘肽或半胱氨酸，1-10mM氧化型谷胱甘肽或胱氨酸，1-20% (v/v)甘油，10-50mM氯化鎂。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述包涵體蛋白復性后，上樣至親和層析柱，柱上切除位于粘質沙雷氏菌核酸酶N端前的區段，收集含有粘質沙雷氏菌核酸酶的流穿液，純化得到的有活性的粘質沙雷氏菌核酸酶。

9.一種用于在大腸桿菌中表達的構建體，其特征在于，其包含與所述突變型SUMO3標簽操作性連接的粘質沙雷氏菌核酸酶的編碼核酸；所述的突變型SUMO3標簽位于N端，所述粘質沙雷氏菌核酸酶位于C端，所述的粘質沙雷氏菌核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示, 所述突變型SUMO3標簽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

10.如權利要求9所述的用于在大腸桿菌中表達的構建體，其特征在于，所述的突變型SUMO3標簽的N端還包括His標簽。

11.一種宿主細胞，其特征在于，其為大腸桿菌，其包含權利要求9所述的用于在大腸桿菌中表達的構建體。

12.權利要求9所述的構建體的應用，其特征在于，用于在大腸桿菌中制備重組粘質沙雷氏菌核酸酶，提高其包涵體蛋白復性率。

13.一種用于重組表達外源蛋白的試劑盒，其特征在于，其中包括權利要求9所述的構建體, 或權利要求11所述的宿主細胞。

14.如權利要求13所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括選自下組的試劑：

SUMO蛋白水解酶；和/或

清洗液；和/或

溶解液；和/或

復性液。

15.如權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述SUMO蛋白水解酶為SUMO特異性蛋白酶2；和/或

所述清洗液包括：10-50mM三羥甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1%Triton X-100；和/或

所述溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM二硫蘇糖醇；和/或

所述復性液包括：0.2-2M L-精氨酸，10-200mM三羥甲基氨基甲烷pH8.0，1-10mM還原型谷胱甘肽或半胱氨酸，1-10mM氧化型谷胱甘肽或胱氨酸，1-20% (v/v)甘油，10-50mM氯化鎂。