[發明專利]一種不依賴PCR反應的短片段克隆方法

有效

• 申請號: 202110499606.4
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113215145B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 何世斌;王翔伍;郝云飛;王鮮萍;張鵬輝;吉逢逢
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

本申請屬于生物工程技術領域，具體涉及一種不依賴PCR反應的短片段快速克隆方法。該方法包括：線性化載體、設計并合成兩條部分互補的長鏈寡核苷酸序列、制備目的序列、同源重組、轉化、篩選，獲得重組載體等步驟。本申請中，發明人對現有重組反應中目的片段的制備方法進行了進一步改進，利用單鏈重組方式延長了插入序列的長度，并利用大腸桿菌的天然修復系統完成了雙鏈補全，從而達到短片段快速克隆目的。該發明保留了現有重組方法簡單快捷的技術特點，同時兼具了現有連接方法在連接長度方面的技術優勢。可為重組質粒改造（例如酶切位點改造、蛋白表達標簽的添加等）奠定良好的技術基礎。

技術領域

本申請屬于生物工程技術領域，具體涉及一種不依賴PCR反應的短片段快速克隆方法。

背景技術

基因克隆是基因研究的主要技術手段，通常需要借助于不同類型載體才能實現目的基因的克隆和表達。實際操作中，載體通常需要經過改造才能滿足實驗的需要，例如多克隆酶切位點的替換以及表達標簽的添加或去除。這些改造往往只需要替換很短的片段就可以完成。

現有技術中，針對短片段（一般指100 bp以下片段）基因克隆時，依據是否依賴PCR反應，可以分為如下兩類。

依賴PCR反應的方法：這種方法與長片段克隆的策略一樣，首先設計含有酶切位點的引物序列，通過PCR反應擴增目的序列、并純化回收目的片段，隨后，利用T4連接酶或重組酶，將目的片段與預先處理后的線性化載體進行連接。這種方法的主要缺陷在于：操作繁瑣、花費時間長：需要模板且PCR擴增后，需要凝膠電泳鑒定、純化回收等操作。另一方面，由于短片段序列擴增后的回收效率較低，而且PCR反應會產生錯配，因此后期需要挑選多個克隆排除突變的克隆，由此導致操作成本較高。

不依賴PCR的方法：又可分為重組和連接兩種類型；如果是通過重組的方式，按照現行的技術要求，需要合成兩個完全互補且兩端含有載體同源臂序列的引物，與線性化載體進行重組反應。這種方法的優點是操作簡單，但是主要缺陷是連接片段短。這種方式如果合成兩條60 bp的寡核苷酸引物序列，插入長度最長只有30 bp。如果是通過連接的方式，需要設計一對部分重疊的寡核苷酸引物，退火后兩端產生酶切位點，通過連接酶連接到載體中。這種方式如果合成兩條60 bp的寡核苷酸引物，插入長度可達到56 bp。目前這種方法廣泛應用于基因編輯載體sgRNA (small guide RNA) 的克隆和RNA干涉載體shRNA (shorthairpin RNA)的克隆。這種連接方法雖然可以保證連接長度，但是操作復雜費時。其主要原因在于合成的寡核苷酸片段的5’端一般為-OH，因此需要使用T4多聚核苷酸激酶將5’末端磷酸化后才能進行連接反應，另外還需要加熱使多聚核苷酸激酶失活和隨后的連接反應。

總之，基于實際質粒改造需要，結合短片段特點，有針對性的對相關克隆方法進行進一步改進，對于相關生物技術的發展具有十分重要的技術意義。

發明內容

鑒于長序列（一般值100 bp以上）DNA片段合成時間較長、價格成本較高現狀，以及現有短片段克隆方法無法較好兼顧操作的便捷和更長的插入長度的技術局限，針對部分短片段序列克隆需要，在現有不依賴于PCR反應的重組方法基礎上，本申請目的在于提供一種改進的不依賴于PCR反應的重組方法，從而為短片段的簡單快速克隆、以及重組質粒改造奠定一定技術基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種不依賴PCR反應的短片段克隆方法，具體步驟如下：

（一）制備線性化載體

對載體進行單酶切或雙酶切，以使載體線性化；并回收、純化酶切后線性化載體；

實際操作中，對載體優選采用雙酶切方式進行線性化處理，以避免線性化后載體的自連；