[發明專利]一種不依賴PCR反應的短片段克隆方法

有效

• 申請號: 202110499606.4
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113215145B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 何世斌;王翔伍;郝云飛;王鮮萍;張鵬輝;吉逢逢
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

1.一種不依賴PCR反應的短片段克隆方法，其特征在于，具體步驟如下：

（一）制備線性化載體

對載體進行單酶切或雙酶切，以使載體線性化；并回收、純化酶切后的線性化載體；

所述載體為pTRV2或pRI101-AN；

具體雙酶切線性化時，采用EcoRI 、XhoI對pTRV2載體進行雙酶切，采用NdeI、BamHI對pRI101-AN載體進行雙酶切；

（二）設計并合成兩條部分互補的長鏈寡核苷酸序列

設計并合成兩條長鏈寡核苷酸片段Oligo F和Oligo R，兩條長鏈寡核苷酸片段的序列的排列方式為：5’－載體同源序列＋酶切位點序列＋目的序列－3’；

其中，兩條長鏈寡核苷酸片段序列的5’末端分別與所用線性化載體兩端存在同源序列，兩條長鏈寡核苷酸片段之間的3’末端目的序列存在部分互補序列；

目的序列的長度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c；

其中：n1、a1、b1分別為Oligo F的總長度、Oligo F與載體同源序列的長度、載體一端酶切位點的長度；

n2、a2、b2分別為Oligo R的總長度、Oligo R與載體同源序列的長度、載體另一端酶切位點的長度；

同時，a1≥15 nt，a2≥15 nt；

c為Oligo F和Oligo R互補序列長度，c≥15 nt，且Oligo F和Oligo R 的3’末端互補序列的Tm值應≥40℃；

（三）制備目的序列

對Oligo F、Oligo R進行退火處理；

（四）同源重組

將步驟（三）中退火后產物與步驟（一）中線性化載體進行單鏈重組；

（五）轉化、篩選，獲得重組載體

將步驟（四）中單鏈重組后產物進一步轉化大腸桿菌并進一步進行篩選驗證。

2.如權利要求1所述不依賴PCR反應的短片段克隆方法，其特征在于，具體50 μL酶切體系及反應條件設計如下：

pTRV2載體或pRI101-AN載體，2000 ng；

內切酶1，2 μL；

內切酶2，2 μL；

10x Cut smart buffer，5 μL；

ddH₂O，補足至50 μL；

37℃酶切過夜。