[發(fā)明專利]一種獲得已知TDNA側(cè)翼序列插入基因組位點的方法

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• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113106117A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李陽;張越
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種獲得已知TDNA側(cè)翼序列插入基因組位點的方法。本發(fā)明通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)基因植株，插入植物基因組的部分為轉(zhuǎn)基因載體上LB到RB區(qū)間的部分，通過已知的TDNA側(cè)翼序列中的LB—RB區(qū)間得到插入位置附近植物基因組序列信息，從而得到轉(zhuǎn)基因插入基因組的位置信息；另外，本發(fā)明不需要繁瑣的實驗過程以及大量的測序分析，就可得到基因組序列信息，通過一次PCR程序即可完成特異性片段的富集，在一代測序的少量數(shù)據(jù)中即可分析得到插入位置的信息，簡單高效，具有一定的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得已知TDNA側(cè)翼序列插入基因組位點的方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因檢測過程中，常用PCR技術(shù)檢測目的基因是否存在，一般使用southern雜交檢測目的基因的拷貝數(shù)，用qPCR技術(shù)檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況，用Tail PCR鑒定目標(biāo)基因在基因組中的插入情況等；通過對插入基因組位點進行分析，人們可以判斷不同的轉(zhuǎn)基因株系，以及轉(zhuǎn)基因的純合和雜合情況，也更容易跟蹤目標(biāo)基因的情況，所以插入位點的鑒定是轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用所必須的。

根據(jù)目前農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的原理，外源基因在基因組中的插入位點是隨機的，在每一次轉(zhuǎn)化事件中，外源基因在基因組中的側(cè)翼序列是獨特的，因此，可以通過檢測側(cè)翼序列來區(qū)分不同的轉(zhuǎn)基因株系。目前已有文獻報道了玉米、油菜、大豆、水稻等轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化事件的具體檢測方法，這種檢測方法為轉(zhuǎn)基因作物的育種、生產(chǎn)、加工和銷售提供可靠的技術(shù)支持。文獻(劉東波,邢國杰,趙倩倩,等.抗病毒轉(zhuǎn)基因大豆事件外源T-DNA序列分析及定性檢測[J].大豆科學(xué),2020(1))中，作者通過Illumina Xten平臺，對大豆進行全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)，并結(jié)合生物信息學(xué)分析和PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因事件的旁側(cè)序列進行了分析，通過全基因組測序，并與大豆參考基因組(Wm82.a2.v1)和轉(zhuǎn)化載體序列做比較，初步找到插入序列T-DNA的邊界及其旁側(cè)序列，結(jié)果證明了全基因組測序在識別轉(zhuǎn)基因作物T-DNA插入和旁側(cè)序列區(qū)域方面的有效性和穩(wěn)定性。文獻(魏歲軍,鄧力華,肖國櫻.轉(zhuǎn)基因水稻EB7001S事件特異性檢測方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2014,22(5):621-631.)中，作者利用利用高效熱不對稱PCR(high efficient thermal asymmetricinterlaced PCR，hiTAIL—PCR)和長距離PCR法(10ng—distance PCR，LD—PCR)擴增獲得了轉(zhuǎn)基因水稻EB7001S中外源基因插入位點的旁側(cè)序列，此方法特異性較強、穩(wěn)定性好、靈敏度高，在模板中摻入EB7001S基因組DNA的量為0.1％時仍可以通過普通PCR方法檢測出來。

以往的研究方法所提供的都是經(jīng)過大量的pcr實驗以及高通量測序來分析外源T-DNA的插入，盡管結(jié)果特異性高，準(zhǔn)確性高，但過程復(fù)雜，耗費大量的人力物力。為了分析轉(zhuǎn)基因表達載體轉(zhuǎn)入植株后，在植物基因組中的插入情況以及對植物基因組的影響，本研究提供一種新型的分析方法，不需要繁瑣的實驗過程以及大量的測序分析，就可得到基因組序列信息。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種獲得已知TDNA側(cè)翼序列插入基因組位點的方法。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)基因植株，插入植物基因組的部分為轉(zhuǎn)基因載體上LB到RB區(qū)間的部分，通過已知的TDNA側(cè)翼序列中的LB—RB區(qū)間得到插入位置附近植物基因組序列信息，從而得到轉(zhuǎn)基因插入基因組的位置信息。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種獲得已知TDNA側(cè)翼序列插入基因組位點的方法，包括如下步驟：

S1、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將包含有已知TDNA側(cè)翼序列的載體轉(zhuǎn)化到植株中，獲得轉(zhuǎn)基因陽性苗；

S2、在所述已知TDNA側(cè)翼序列的RB端找到一個4堿基酶切位點和/或6堿基酶切位點；