[發明專利]一種獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法

在審

• 申請號: 202110499333.3
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113106117A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 李陽;張越
• 申請（專利權）人: 武漢伯遠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、通過農桿菌介導法，將包含有已知TDNA側翼序列的載體轉化到植株中，獲得轉基因陽性苗；

S2、在所述已知TDNA側翼序列的RB端找到一個4堿基酶切位點和/或6堿基酶切位點；

S3、提取所述轉基因陽性苗的基因組DNA，選擇4堿基酶切位點和/或6堿基酶切位點的限制性內切酶對所述基因組DNA進行酶切操作，獲得不同長度的基因片段；

S4、使用DNA連接酶對所述基因片段進行酶連操作，獲得成環片段；根據所述酶切位點的右側序列并設計一對特異性的引物對成環的片段進行擴增，向兩端反向延長連成線性片段；

S5、對所述線性片段進行回收、純化后，送一代測序，將獲得的測序結果與數據庫中基因組數據進行比對，即可獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點信息。

2.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S2中，所述已知TDNA側翼序列的RB端序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S2中，所述4堿基酶切位點為Tail酶切位點。

4.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S2中，所述6堿基酶切位點為HindⅢ酶切位點。

5.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S3中，所述Tail酶切位點具體酶切反應過程如下：加入8μL基因組DNA、1μL 10×酶切buffer、1μL Tail內切酶，在65℃的條件下反應4h，之后在80℃的條件下加熱失活。

6.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S3中，所述HindⅢ酶切位點具體酶切反應過程如下：加入8μL基因組DNA、1μL 10×酶切buffer、1μL HindⅢ內切酶，在37℃的條件下反應4h，之后在80℃的條件下加熱失活。

7.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S4中，所述酶連反應過程如下：加入10μL酶切產物、1μL T4連接酶、1μL 10×連接酶buffer，在16℃的條件下反應5h，之后在4℃的條件下保存。

8.如權利要求1所述的獲得已知TDNA側翼序列插入基因組位點的方法，其特征在于，步驟S4中，所述特異性的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。