[發(fā)明專利]一種普卡那肽的合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110497892.0
• 申請(qǐng)日: 2021-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN113512091B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊秋初;陳逸民;吳艷;朱友耀;熊玲媛;王宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 漳州未名博欣生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 廈門市精誠(chéng)新創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發(fā)明公開了一種普卡那肽的合成方法。該方法包括在活化劑的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc?Leu?OH偶聯(lián)得到Fmoc?Leu?樹脂，通過固相合成法，按照普卡那肽主鏈肽順序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，偶聯(lián)完之后裂解，使得普卡那肽從樹脂上脫除并脫除掉全部側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，裂解之后凍干得到普卡那肽線性粗肽；將所得的普卡那肽線性粗肽溶于溶劑中得到溶解液，溶解液中溶質(zhì)/溶劑的質(zhì)量體積比為0.1?1.0mg/mL，然后進(jìn)行環(huán)化，分離純化得到環(huán)化好的普卡那肽，凍干得到精肽。該方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，錯(cuò)配率低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)合成領(lǐng)域，尤其涉及一種普卡那肽的合成方法。

背景技術(shù)

目前普卡合成方法常規(guī)有二：一是先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法將六肽片段偶聯(lián)至固相樹脂上，利用固相樹脂的假稀釋效應(yīng)在固相樹脂上通過對(duì)Cys不同位置的保護(hù)基，直完成兩個(gè)二硫環(huán)的選擇性合成，之后將其從樹脂上切割下來進(jìn)行純化。但是用酶促反應(yīng)將片段偶聯(lián)至固相樹脂，產(chǎn)率低，不適用于工業(yè)生產(chǎn)；選擇性去除Cys上特殊保護(hù)基團(tuán)較為困難，條件苛刻；且在固相樹脂上進(jìn)行第一對(duì)二硫鍵環(huán)化方法復(fù)雜，得率低。二是在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-Leu-OH偶聯(lián)得到Fmoc-Leu-樹脂，通過固相合成法，按照普卡那肽主鏈肽順序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，按照普卡那肽主鏈肽序依次進(jìn)行氨基酸的偶聯(lián)，合成完畢之后進(jìn)行裂解，在水溶液或者DMSO溶液中進(jìn)行液相環(huán)化，最后純化，凍干后得到普卡那肽；但是在高氧化能力下，二硫鍵錯(cuò)配程度高，導(dǎo)致最終純化困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，錯(cuò)配率低的普卡那肽的合成方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種普卡那肽的合成方法，其特征在于，合成步驟包括：

獲取線性肽：在活化劑的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-Leu-OH偶聯(lián)得到Fmoc-Leu-樹脂，通過固相合成法，按照普卡那肽主鏈肽順序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，偶聯(lián)完之后裂解，使得普卡那肽從樹脂上脫除并脫除掉全部側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，裂解之后凍干得到普卡那肽線性粗肽；

環(huán)化步驟：將所得的普卡那肽線性粗肽溶于溶劑中得到溶解液，溶解液中溶質(zhì)/溶劑的質(zhì)量體積比為0.1-1.0mg/mL，然后進(jìn)行環(huán)化，所述環(huán)化所用的環(huán)化液為0.1-1M?NaCl、0.1-1M?Tris-HCl、5-10mM?GSH和0.5-1mM?GSSG和0.1-0.5mM鹽酸胍，pH值為7.5；

純化：分離純化得到環(huán)化好的普卡那肽，凍干得到精肽。

進(jìn)一步，所述溶劑為水或者有機(jī)溶劑。

進(jìn)一步，所述有機(jī)溶劑為乙腈。

進(jìn)一步，所述環(huán)化步驟中的環(huán)化為將溶解液緩慢滴入到環(huán)化液中密封，黑暗下0-6℃放置12-24h。

進(jìn)一步，所述環(huán)化步驟中的環(huán)化為黑暗下0-6℃放置20-24h。

進(jìn)一步，所述環(huán)化步驟中的環(huán)化通過加入50％TFA終止反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述普卡那肽線性粗肽與環(huán)化液的用量比為5mg：50mL。

所述環(huán)化液為0.1-1M?NaCl、0.1-1M?Tris-HCl、5-10mM?GSH和0.5-1mM?GSSG和0.1-0.5mM鹽酸胍，pH值為7.5。0.1-1M?NaCl是用于保證環(huán)化液的離子平衡，Tris-HCl是緩沖體系，與NaCl一起保證溶液內(nèi)離子平衡和酸堿度不變，5-10mM?GSH和0.5-1mM?GSSG是用于氧化形成2硫鍵的關(guān)鍵，鹽酸胍的作用是破壞形成好的二硫鍵，整個(gè)環(huán)化過程在PH7.5的緩沖體系下，GSH與GSSH的氧化還原對(duì)不斷形成，鹽酸胍不斷破環(huán)，最終形成最穩(wěn)定的二硫鍵構(gòu)象，GSH濃度是GSSH的5倍過量，可使形成2硫鍵的速度大于鹽酸胍破環(huán)速度，可使得最終反應(yīng)完之后都是已環(huán)化的產(chǎn)品。