[發明專利]一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法

在審

• 申請號: 202110497755.7
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113201561A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 葉建強;李露媛;李拓凡;萬志敏;秦愛建;邵紅霞;謝泉;相汝蘋
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/55;C12N15/12;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發明涉及到一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，本發明的原理和最核心的關鍵技術是科學合理的構建了靶向雞NHE1基因W38位氨基酸的sgRNA，之后轉染帶有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2質粒，利用CRISPR?Cas9系統達到基因位點的精確敲除，通過藥物篩選及亞克隆的方法獲得單克隆細胞株，從而獲得雞源NHE1基因W38位敲除的細胞系。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及到一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，具體為一種基于CRISPR-Cas9編輯技術的精確敲除雞 NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法。

背景技術

CRISPR-Cas系統最早發現于細菌的天然免疫系統，用于對抗病毒的入侵和外源DNA。其中Ⅱ型CRISPR-Cas系統運用最為廣泛，主要由RNA導向的Cas9核酸內切酶、一條導向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)組成。在這一系統中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA結合形成雙鏈RNA，引導Cas9蛋白到靶序列上，在PAM序列上游3bp位置特異性剪切DNA 雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂(DSB，double strand break)，從而啟動細胞內的DNA 損傷修復機制，導致修復后發生堿基缺失或插入，達到移碼突變的效果，最終實現基因敲除的目的。目前該技術已經成熟的運用于真核細胞的基因組編輯中。

Na+/H+離子交換蛋白-1(Sodium/hydrogen exchanger 1，NHE1)是存在于細胞膜表面的離子轉運泵蛋白家族的一員。NHE1具有維持細胞內pH值等內環境穩定以及調控宿主細胞的凋亡和增殖的重要功能，也是首個被鑒定的J亞群禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV-J)的細胞受體，該蛋白存在于所有真核細胞膜上。ALV-J的Env可特異性的結合雞NHE1位于細胞外環-1 (Loop-1)的28-39位氨基酸，并以此介導ALV-J的入侵及感染，而對ALV-J 不易感的禽類NHE1的W38氨基酸存在變異或缺失。本研究通過CRISPR/Cas9技術，藥物篩選后通過亞克隆的方法，成功獲得雞源NHE1基因W38位精確敲除的 DF-1細胞株delW38-NHE1，且發現delW38-NHE1細胞系能夠有效封閉ALV-J的感染。本發明為探究NHE1基因W38氨基酸生物學功能，解析NHE1基因W38位點與ALV-J互作分子機制以及為構建抗ALV-J轉基因雞與抗病毒藥物開發打下了基礎，具有良好的應用研究價值。

發明內容

本發明的目的是針對上述現有問題，提供一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種精確敲除雞NHE1基因W38 位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1)、構建一種特異性靶向雞NHE1基因W38位的sgRNA，所述的sgRNA位于雞NHE1基因的第一個外顯子區域，且靶序列唯一；

步驟2)、準備一種用于靶向敲除雞NHE1基因W38位的CRISPR-Cas9系統， CRISPR-Cas9系統中含有Cas9蛋白和上述特異性靶向雞NHE1基因W38位的sgRNA，或者含有攜帶編碼Cas9蛋白的編碼序列和編碼sgRNA的編碼序列；CRISPR-Cas9 系統中，Cas9蛋白的編碼序列與sgRNA的編碼序列位于同一質粒上，所述的質粒為lentiCRISPR v2；

步驟3)、合成以pUC57為骨架，含有缺失NHE1基因W38位所需的供體質粒，并命名為：pUC57-delW38；

步驟4)、將步驟1)構建的特異性靶向敲除雞NHE1基因W38位的sgRNA克隆至帶有Cas9基因的lentiCRISPR v2質粒，并將lentiCRISPR v2質粒與步驟3)構建的供體質粒pUC57-delW38共同轉染至細胞中；