[發明專利]一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法

在審

• 申請號: 202110497755.7
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113201561A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 葉建強;李露媛;李拓凡;萬志敏;秦愛建;邵紅霞;謝泉;相汝蘋
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/55;C12N15/12;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

1.一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1）、構建一種特異性靶向雞NHE1基因W38位的sgRNA，所述的sgRNA位于雞NHE1基因的第一個外顯子區域，且靶序列唯一；

步驟2）、準備一種用于靶向敲除雞NHE1基因W38位的CRISPR-Cas9系統，CRISPR-Cas9系統中含有Cas9蛋白和上述特異性靶向雞NHE1基因W38位的sgRNA，或者含有攜帶編碼Cas9蛋白的編碼序列和編碼sgRNA的編碼序列；CRISPR-Cas9系統中，Cas9蛋白的編碼序列與sgRNA的編碼序列位于同一質粒上，所述的質粒為lentiCRISPR v2；

步驟3）、合成以pUC57為骨架，含有缺失NHE1基因W38位所需的供體質粒，并命名為：pUC57-delW38；

步驟4）、將步驟1）構建的特異性靶向敲除雞NHE1基因W38位的sgRNA克隆至帶有Cas9基因的lentiCRISPR v2質粒，并將lentiCRISPR v2質粒與步驟3）構建的供體質粒pUC57-delW38共同轉染至細胞中；

利用CRISPR-Cas9系統達到基因位點精準敲除，通過藥物篩選和亞克隆的方法最后獲得陽性單克隆細胞株，從而獲得雞源NHE1基因W38位敲除細胞系。

2.根據權利要求1所述的一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，

步驟1）中，對雞NHE1基因設計了1條sgRNA，所述sgRNA靶位點位于NHE-1基因的第一個外顯子區域，該外顯子序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的特異性靶向雞NHE1基因W38位的sgRNA編碼鏈及互補鏈；其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，

步驟1）中，靶向雞NHE1基因的sgRNA制備方法，包括將合成的sgRNA編碼鏈和互補鏈退火形成雙鏈DNA，之后通過BsmBⅠ限制性內切酶酶切載體，將雙鏈DNA置于T7啟動子之下構建獲得。

4.根據權利要求1所述的一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，

步驟3）中，對雞NHE1蛋白設計了缺失W38位點的模板供體質粒，所述缺失位點位于NHE1基因的第一個外顯子區域，該供體質粒序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根據權利要求1所述的一種精確敲除雞NHE1基因W38位氨基酸的細胞系構建方法，其特征在于，

步驟4）中，所述的細胞系為敲除雞NHE1基因W38位點的細胞系。